Υπολογιστής Μοριακού Βάρους Πρωτεΐνης | Δωρεάν Εργαλείο MW

Υπολογιστής μοριακού βάρους πρωτεΐνης

Ένας υπολογιστής μοριακού βάρους πρωτεΐνης βρίσκει τη μάζα μιας πρωτεΐνης από την αλληλουχία αμινοξέων της. Το αποτέλεσμα δίνεται σε Dalton (Da), την τυπική μονάδα μοριακής μάζας. Ένα Dalton είναι κοντά στη μάζα ενός μεμονωμένου ατόμου υδρογόνου.

Το μοριακό βάρος έχει σημασία στην καθημερινή εργαστηριακή εργασία. Βοηθά τον ερευνητή να επιλέξει την κατάλληλη συγκέντρωση γέλης για SDS-PAGE, να επιλέξει στήλη για διήθηση μέσω γέλης και να ελέγξει αν ένα αποτέλεσμα φασματομετρίας μάζας συμφωνεί με την αναμενόμενη πρωτεΐνη. Η τιμή που δίνει ο υπολογιστής είναι θεωρητικό βάρος, βασισμένο μόνο στην αλληλουχία. Οι πραγματικές πρωτεΐνες μπορεί να ζυγίζουν περισσότερο λόγω χημικών προσθηκών που πραγματοποιούνται μετά τη σύνθεση της πρωτεΐνης και ονομάζονται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Αυτές κυμαίνονται από λίγα Dalton για μία φωσφορική ομάδα έως δεκάδες χιλιάδες Dalton για μεγάλες αλυσίδες σακχάρων.

Πώς υπολογίζεται το μοριακό βάρος μιας πρωτεΐνης

Ο τύπος

$MW_{protein} = \sum_{i=1}^{n} MW_{residue_i} + MW_{water}$

Κάθε αμινοξύ σε μια αλυσίδα συνεισφέρει το βάρος του καταλοίπου και όχι το βάρος του ελεύθερου αμινοξέος. Όταν δύο αμινοξέα ενώνονται με πεπτιδικό δεσμό, η αντίδραση απελευθερώνει ένα μόριο νερού. Τα βάρη των καταλοίπων έχουν ήδη υπολογιστεί με την αφαίρεση αυτού του νερού, επομένως το άθροισμα της αλληλουχίας συνυπολογίζει αυτόματα όλους τους εσωτερικούς πεπτιδικούς δεσμούς.

Μετά την άθροιση των καταλοίπων, προστίθεται ξανά ένα μόριο νερού (18,010565 Da). Αυτό καλύπτει τα δύο ελεύθερα άκρα της αλυσίδας: ένα άτομο υδρογόνου στην αρχή (το Ν-τελικό άκρο) και μια υδροξυλομάδα στο τέλος (το C-τελικό άκρο).

Ένα συνηθισμένο λάθος είναι να αφαιρείται νερό για κάθε πεπτιδικό δεσμό και στη συνέχεια να προστίθεται ξεχωριστά ένα μόριο νερού. Έτσι υπολογίζεται δύο φορές η απώλεια νερού, επειδή τα βάρη των καταλοίπων που παρατίθενται παρακάτω την έχουν ήδη εξαιρέσει. Ο μοναδικός όρος νερού στον υπολογισμό είναι αυτός που προστίθεται στο τέλος.

Βάρη καταλοίπων αμινοξέων

Πρόκειται για μονοϊσοτοπικές μάζες καταλοίπων, σε Ντάλτον, για τα 20 τυπικά αμινοξέα:

Παράδειγμα υπολογισμού

Πάρτε ως παράδειγμα τη μικρή αλυσίδα Αλανίνη-Γλυκίνη-Σερίνη, που γράφεται ως AGS.

1. Προσθέστε τα βάρη των καταλοίπων: 71,03711 + 57,02146 + 87,03203 = 215,0906 Da.
2. Προσθέστε ένα μόριο νερού για τα δύο άκρα της αλυσίδας: 215,0906 + 18,010565 = 233,101165 Da.
3. Στρογγυλοποιημένο σε δύο δεκαδικά ψηφία, το μοριακό βάρος του AGS είναι 233,10 Da.

Δεν αφαιρείται επιπλέον νερό για τους δύο πεπτιδικούς δεσμούς αυτού του τριπεπτιδίου. Η απώλεια αυτή περιλαμβάνεται ήδη στα τρία βάρη καταλοίπων που χρησιμοποιούνται στο βήμα 1.

Πώς χρησιμοποιείται ο υπολογιστής μοριακού βάρους πρωτεΐνης

1. Εισαγάγετε μια αλληλουχία χρησιμοποιώντας τους τυπικούς μονογράμματους κωδικούς αμινοξέων, όπως MVKMDVYKGSSIGDSMSRSM. Λειτουργούν τόσο τα κεφαλαία όσο και τα πεζά γράμματα.
2. Ο υπολογιστής ελέγχει την αλληλουχία καθώς πληκτρολογείται και επισημαίνει κάθε χαρακτήρα που δεν είναι ένας από τους 20 τυπικούς κωδικούς.
3. Εμφανίζει το μοριακό βάρος σε Dalton, το μήκος της αλληλουχίας και ανάλυση της σύστασης σε αμινοξέα.
4. Τα αποτελέσματα μπορούν να αντιγραφούν με ένα κλικ για εργαστηριακά σημειωματάρια ή αναφορές.

Πριν επικολλήσετε μια αλληλουχία από βάση δεδομένων όπως η UniProt, αφαιρέστε τη γραμμή κεφαλίδας FASTA (τη γραμμή που αρχίζει με >) και τυχόν αριθμούς θέσεων από λογισμικό ευθυγράμμισης. Τα γράμματα X, B, Z και J δεν είναι τυπικοί κωδικοί αμινοξέων και θα απορριφθούν· αντικαταστήστε τα με ένα συγκεκριμένο αμινοξύ πριν από τον υπολογισμό.

Γιατί έχει σημασία το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης

• Ηλεκτροφόρηση σε γέλη (SDS-PAGE): οι μικρές πρωτεΐνες κάτω από 20 kDa χρειάζονται γέλη υψηλότερου ποσοστού για καλό διαχωρισμό, ενώ οι μεγάλες πρωτεΐνες πάνω από 100 kDa χρειάζονται χαμηλότερο ποσοστό.
• Διήθηση μέσω γέλης: το εύρος μοριακού βάρους μιας πρωτεΐνης καθορίζει ποια ρητίνη στήλης θα τη διαχωρίσει σωστά.
• Φασματομετρία μάζας: το υπολογισμένο βάρος συγκρίνεται με το μετρούμενο βάρος για επιβεβαίωση της ταυτότητας ή για ανίχνευση απρόσμενων αλλαγών.
• Σύνθεση πεπτιδίων: το μοριακό βάρος καθορίζει την ακριβή ποσότητα αρχικού υλικού που απαιτείται για κάθε στάδιο σύζευξης.
• Υπολογισμοί ρυθμιστικών διαλυμάτων και δόσεων: η μετατροπή μεταξύ μοριακότητας και συγκέντρωσης κατά μάζα απαιτεί το μοριακό βάρος.

Περιορισμοί

Ο υπολογιστής δίνει θεωρητικό βάρος βασισμένο μόνο στην αλληλουχία. Δεν περιλαμβάνει:

• Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως οι αλυσίδες σακχάρων που προστίθενται κατά τη γλυκοζυλίωση ή οι φωσφορικές ομάδες που προστίθενται κατά τη φωσφορυλίωση. Αυτές πρέπει να προστεθούν χειροκίνητα ή να μετρηθούν με φασματομετρία μάζας.
• Δισουλφιδικούς δεσμούς. Κάθε δεσμός μεταξύ δύο καταλοίπων κυστεΐνης αφαιρεί δύο άτομα υδρογόνου, περίπου 2,02 Da ανά δεσμό. Ο υπολογιστής θεωρεί ότι όλες οι κυστεΐνες είναι μη συνδεδεμένες.
• Μη τυπικά αμινοξέα, όπως η σεληνοκυστεΐνη ή η πυρρολυσίνη, και χημικά τροποποιημένα κατάλοιπα όπως η υδροξυπρολίνη.
• Συμπαράγοντες, όπως ομάδες αίμης ή μεταλλικά ιόντα που συνδέονται με την πρωτεΐνη.

Συχνές ερωτήσεις

Τι είναι το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης; Είναι η συνολική μάζα μιας πρωτεΐνης, που συνήθως δίνεται σε Ντάλτον (Da) ή κιλοΝτάλτον (kDa), όπου 1 kDa ισούται με 1.000 Da. Ισούται με το άθροισμα των βαρών των καταλοίπων αμινοξέων της αλληλουχίας συν ένα μόριο νερού για τα δύο άκρα της αλυσίδας.

Γιατί ο τύπος προσθέτει νερό αντί να το αφαιρεί; Ο σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού απελευθερώνει ένα μόριο νερού και τα βάρη των καταλοίπων που χρησιμοποιούνται στο άθροισμα έχουν ήδη υπολογιστεί με την αφαίρεση αυτού του νερού. Ένα μόνο μόριο νερού προστίθεται ξανά στο τέλος, για να ληφθούν υπόψη το ελεύθερο υδρογόνο και η υδροξυλομάδα στα δύο άκρα της ολοκληρωμένης αλυσίδας.

Πόσο ακριβές είναι το υπολογισμένο βάρος; Για μια πρωτεΐνη χωρίς χημικές τροποποιήσεις, ο υπολογισμός είναι ακριβής με την ακρίβεια των μαζών αμινοξέων που χρησιμοποιούνται, συνήθως εντός κλάσματος ενός Dalton. Οι πραγματικές πρωτεΐνες με τροποποιήσεις, όπως γλυκοζυλίωση ή δισουλφιδικούς δεσμούς, θα έχουν διαφορετικό βάρος από την υπολογισμένη τιμή.

Μπορεί ο υπολογιστής να χειριστεί τροποποιημένα ή μη τυπικά αμινοξέα; Όχι. Υποστηρίζει μόνο τα 20 τυπικά αμινοξέα. Η σεληνοκυστεΐνη, η πυρρολυσίνη και άλλα τροποποιημένα κατάλοιπα δεν αναγνωρίζονται και πρέπει να αντιμετωπιστούν με χειροκίνητη διόρθωση ή με εξειδικευμένο εργαλείο.

Πώς μετατρέπω τα Dalton σε kilodalton; Διαιρέστε με 1.000. Μια πρωτεΐνη 25.000 Da είναι 25 kDa. Στις επιστημονικές δημοσιεύσεις χρησιμοποιείται συνήθως το Da για μικρά πεπτίδια και το kDa για μεγαλύτερες πρωτεΐνες.

Γιατί το αποτέλεσμα της γέλης ή της φασματομετρίας μάζας δεν συμφωνεί με το υπολογισμένο βάρος; Οι συνηθέστερες αιτίες είναι οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, οι δισουλφιδικοί δεσμοί ή μια πρωτεΐνη που έχει υποστεί πρωτεόλυση και έχει μετατραπεί σε βραχύτερη ώριμη μορφή μετά τη μετάφραση. Μια άλλη αιτία είναι η ασυμφωνία στον τύπο μάζας. Αυτός ο υπολογιστής αναφέρει τη μονοϊσοτοπική μάζα, η οποία χρησιμοποιεί το ελαφρύτερο ισότοπο κάθε ατόμου. Πολλά άλλα εργαλεία, συμπεριλαμβανομένου του ExPASy ProtParam, αναφέρουν τη μέση μάζα. Η μέση μάζα είναι υψηλότερη: κάτω από 1 Da για ένα μικρό πεπτίδιο και κατά δεκάδες Dalton για μια μεγάλη πρωτεΐνη. Η SDS-PAGE μπορεί επίσης να εμφανίσει ζώνη σε παραπλανητική θέση για πολύ όξινες ή πολύ βασικές πρωτεΐνες, επομένως αποτελεί μόνο κατά προσέγγιση εκτίμηση του μοριακού βάρους.