Υπολογιστής Συγκέντρωσης Πρωτεΐνης | A280 σε mg/mL

Υπολογιστής συγκέντρωσης πρωτεΐνης

Ένας υπολογιστής συγκέντρωσης πρωτεΐνης μετατρέπει μια μέτρηση απορρόφησης φωτός από φασματοφωτόμετρο στην ποσότητα πρωτεΐνης που είναι διαλυμένη σε ένα διάλυμα. Το αποτέλεσμα δίνεται συνήθως σε χιλιοστόγραμμα ανά χιλιοστόλιτρο (mg/mL) ή μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο (μg/mL). Ο υπολογισμός βασίζεται στον νόμο Beer–Lambert, μια σχέση στη χημεία που συνδέει την ποσότητα φωτός που απορροφά ένα δείγμα με την ποσότητα μιας ουσίας που περιέχει.

Πώς μετράται η συγκέντρωση πρωτεΐνης

Οι περισσότερες πρωτεΐνες απορροφούν έντονα την υπεριώδη ακτινοβολία σε μήκος κύματος 280 νανομέτρων (nm). Η απορρόφηση αυτή οφείλεται κυρίως σε δύο αμινοξέα, την τρυπτοφάνη και την τυροσίνη, που υπάρχουν στη δομή της πρωτεΐνης. Το φασματοφωτόμετρο στέλνει φως μέσα από το δείγμα και μετρά πόσο από αυτό απορροφά το δείγμα. Η μέτρηση αυτή ονομάζεται απορρόφηση ή A280 όταν πραγματοποιείται στα 280 nm.

Η μέτρηση της απορρόφησης στα 280 nm είναι γρήγορη και δεν καταστρέφει το δείγμα. Αυτό τη διακρίνει από χημικές μεθόδους, όπως η δοκιμασία Bradford ή BCA, που περιγράφονται παρακάτω. Η μέθοδος λειτουργεί καλύτερα σε καθαρισμένη πρωτεΐνη σε διάλυμα, με μέτρηση απορρόφησης μεταξύ περίπου 0,1 και 1,0. Οι μετρήσεις εκτός αυτού του εύρους είναι λιγότερο αξιόπιστες, επομένως συχνά χρειάζεται αραίωση του δείγματος πριν από τη μέτρηση.

Τύπος συγκέντρωσης πρωτεΐνης

Ο υπολογιστής αναδιατάσσει τον νόμο Beer–Lambert για να υπολογίσει τη συγκέντρωση:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — συγκέντρωση πρωτεΐνης, σε mg/mL
• A — απορρόφηση στα 280 nm (απλός αριθμός, χωρίς μονάδα)
• DF — συντελεστής αραίωσης, δηλαδή πόσες φορές αραιώθηκε το αρχικό δείγμα πριν από τη μέτρηση
• ε — συντελεστής απορρόφησης, μια σταθερά ειδική για την πρωτεΐνη, σε L/(g·cm)
• l — μήκος διαδρομής, η απόσταση που διανύει το φως μέσα από το δείγμα, σε cm (συνήθως 1 cm σε μια τυπική κυψελίδα, ένα μικρό γυάλινο ή πλαστικό δοχείο που χρησιμοποιείται στο φασματοφωτόμετρο)

Για τη μετατροπή του αποτελέσματος σε μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο, πολλαπλασιάστε την τιμή σε mg/mL επί 1.000. Για να βρείτε τη συνολική μάζα πρωτεΐνης στο δείγμα, πολλαπλασιάστε τη συγκέντρωση επί τον όγκο του δείγματος σε χιλιοστόλιτρα.

Λυμένο παράδειγμα

Ένα δείγμα δίνει μέτρηση απορρόφησης 0,5 στα 280 nm. Δεν αραιώθηκε, επομένως ο συντελεστής αραίωσης είναι 1, και μετρήθηκε σε τυπική κυψελίδα 1 cm. Η πρωτεΐνη είναι αλβουμίνη ορού βοοειδούς (BSA), η οποία έχει συντελεστή απορρόφησης 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

Σε δείγμα 1 mL, αυτό αντιστοιχεί σε περίπου 0,75 mg συνολικής πρωτεΐνης ή 750 μg/mL.

Συντελεστές απορρόφησης συνήθων πρωτεϊνών

Κάθε πρωτεΐνη απορροφά το φως διαφορετικά, επειδή καθεμία έχει διαφορετικό αριθμό καταλοίπων τρυπτοφάνης και τυροσίνης. Ο συντελεστής απορρόφησης περιγράφει αυτή την ιδιότητα για μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη σε μήκος κύματος 280 nm, σε μονάδες L/(g·cm). Οι τιμές που χρησιμοποιούνται συχνά περιλαμβάνουν:

Ένας υπολογιστής μπορεί επίσης να δεχτεί προσαρμοσμένο συντελεστή απορρόφησης για μια πρωτεΐνη που δεν περιλαμβάνεται σε αυτόν τον κατάλογο. Για μια πρωτεΐνη με γνωστή αλληλουχία αμινοξέων, η τιμή αυτή μπορεί να εκτιμηθεί με έναν τύπο που δημοσιεύτηκε από τους Gill και von Hippel το 1989: ε₂₈₀ = (κατάλοιπα τρυπτοφάνης × 5.500) + (κατάλοιπα τυροσίνης × 1.490) + (κατάλοιπα κυστίνης × 125). Ο τύπος αυτός δίνει αποτέλεσμα σε M⁻¹cm⁻¹, μια μοριακή μονάδα, η οποία διαφέρει από τις παραπάνω τιμές L/(g·cm) που βασίζονται στη μάζα. Δωρεάν εργαλεία, όπως το ProtParam, που φιλοξενείται στον διακομιστή ExPASy, υπολογίζουν απευθείας αυτή την τιμή από μια αλληλουχία πρωτεΐνης.

Μήκος διαδρομής και συντελεστής αραίωσης

Το μήκος διαδρομής είναι το πλάτος της κυψελίδας που περιέχει το δείγμα και μετράται σε εκατοστά. Οι τυπικές κυψελίδες έχουν πλάτος 1 cm. Τα φασματοφωτόμετρα μικροόγκου, τα οποία μετρούν πολύ μικρά δείγματα, μπορεί να χρησιμοποιούν πολύ μικρότερη διαδρομή, όπως 0,1 cm.

Ο συντελεστής αραίωσης λαμβάνει υπόψη κάθε αραίωση που πραγματοποιήθηκε πριν από τη μέτρηση. Αν ένα συμπυκνωμένο δείγμα έδινε απορρόφηση πάνω από 1,0, είναι συνήθης πρακτική να αραιωθεί πρώτα με ρυθμιστικό διάλυμα. Ο συντελεστής αραίωσης ισούται με τον συνολικό όγκο μετά την αραίωση διαιρεμένο με τον αρχικό όγκο του δείγματος. Για παράδειγμα, η ανάμειξη 10 μL δείγματος με 990 μL ρυθμιστικού διαλύματος δίνει συνολικό όγκο 1.000 μL και συντελεστή αραίωσης 100.

Άλλοι τρόποι μέτρησης της συγκέντρωσης πρωτεΐνης

Η απορρόφηση στα 280 nm είναι μία από αρκετές κοινές μεθόδους που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο.

• Δοκιμασία Bradford: χρησιμοποιεί μια χρωστική που αλλάζει χρώμα όταν συνδέεται με πρωτεΐνη. Λειτουργεί καλά σε μη καθαρισμένα δείγματα, αλλά η αλλαγή χρώματος μπορεί να διαφέρει μεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνών.
• Δοκιμασία BCA: βασίζεται σε αλλαγή χρώματος που προκαλείται από τους πεπτιδικούς δεσμούς της πρωτεΐνης. Είναι συμβατή με πολλά απορρυπαντικά, αλλά απαιτεί περισσότερο χρόνο από μια άμεση μέτρηση απορρόφησης.
• Μέθοδος Lowry: παλαιότερη μέθοδος, πολύ ευαίσθητη, η οποία όμως αντιδρά ανεπαρκώς με ορισμένα συνηθισμένα συστατικά ρυθμιστικών διαλυμάτων.

Καθεμία από αυτές τις τρεις μεθόδους καταστρέφει το δείγμα. Η άμεση μέτρηση A280 δεν το καταστρέφει, επομένως το ίδιο δείγμα μπορεί να ανακτηθεί και να χρησιμοποιηθεί ξανά.

Συχνές ερωτήσεις

Ποιο είναι το ιδανικό εύρος απορρόφησης για αυτή τη μέθοδο;

Μεταξύ 0,1 και 1,0. Κάτω από 0,1, η μέτρηση είναι ανακριβής. Πάνω από 1,0, η σχέση μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης μπορεί να μην είναι πλέον γραμμική, επομένως το δείγμα πρέπει πρώτα να αραιωθεί.

Γιατί γίνεται μέτρηση στα 280 nm αντί για 260 nm;

Τα νουκλεϊκά οξέα, όπως το DNA και το RNA, απορροφούν έντονα στα 260 nm. Οι πρωτεΐνες απορροφούν περισσότερο στα 280 nm λόγω της περιεκτικότητάς τους σε τρυπτοφάνη και τυροσίνη. Η μέτρηση στα 280 nm μειώνει τις παρεμβολές από τυχόν νουκλεϊκά οξέα που υπάρχουν στο δείγμα.

Πώς βρίσκεται ο συντελεστής απορρόφησης για μια πρωτεΐνη που δεν περιλαμβάνεται στον κατάλογο;

Για μια πρωτεΐνη με γνωστή αλληλουχία, ένα εργαλείο όπως το ProtParam τον υπολογίζει από τον αριθμό των καταλοίπων τρυπτοφάνης, τυροσίνης και κυστίνης. Μπορεί επίσης να μετρηθεί απευθείας, με σύγκριση της απορρόφησης του δείγματος με εκείνη ενός διαλύματος γνωστής συγκέντρωσης.

Λειτουργεί αυτή η μέθοδος για μείγμα πρωτεϊνών;

Λειτουργεί καλύτερα για μία μεμονωμένη, καθαρισμένη πρωτεΐνη με γνωστό συντελεστή απορρόφησης. Ένα μείγμα άγνωστων πρωτεϊνών, όπως ένα κυτταρικό λύμα, συνήθως μετράται με τη δοκιμασία Bradford ή BCA, επειδή αυτές οι μέθοδοι δίνουν πιο συνεπή εκτίμηση της συνολικής πρωτεΐνης.

Μπορούν τα απορρυπαντικά να επηρεάσουν τη μέτρηση;

Ναι. Πολλά απορρυπαντικά απορροφούν φως κοντά στα 280 nm, γεγονός που μπορεί να αλλοιώσει το αποτέλεσμα. Η χρήση τυφλού δείγματος που περιέχει την ίδια συγκέντρωση απορρυπαντικού βοηθά στην εξάλειψη αυτής της απορρόφησης υποβάθρου. Πολύ υψηλές συγκεντρώσεις απορρυπαντικού μπορεί να απαιτούν δοκιμασία συμβατή με απορρυπαντικά, όπως η BCA.