Ensüümi aktiivsuse kalkulaator - Michaelis-Menteni kineetika

Ensüümi aktiivsuse kalkulaator

Ensüümi aktiivsuse kalkulaator leiab, kui kiiresti muudab ensüüm substraadi produktiks; tulemus väljendatakse eriaktiivsusena ühikutes milligrammi kohta (U/mg). See kasutab Michaelise–Menteni võrrandit, ensüümikineetika standardmudelit, koos proovis oleva ensüümivalgu kogusega.

Ensüümid on valgud, mis kiirendavad rakkudes keemilisi reaktsioone, ilma et nad ise ära kuluksid. Teadlased mõõdavad ensüümi aktiivsust, et võrrelda eri partiisid, kontrollida puhastusetapi toimivust või uurida, kuidas ravim mõjutab ensüümi kiirust. Ainuüksi ensüümi kontsentratsiooni arv ei näita, kas ensüüm täidab oma ülesannet. Seda näitab eriaktiivsus.

Mida kalkulaator arvutab

Tööriist kasutab viit sisendit: ensüümi kontsentratsioon, substraadi kontsentratsioon, Michaelise konstant (Km), maksimaalne kiirus (Vmax) ja reaktsiooniaeg. Reaktsiooniaeg registreeritakse võrdluseks, kuid see ei kuulu valemisse. Vmax on juba kiirus ehk minutis muundatud substraadi kogus, seega on aeg sellesse sisse arvestatud. Aja uuesti jagamine arvestaks seda kaks korda.

Kalkulaator annab ühe arvu ja ühe diagrammi:

• Eriaktiivsus, ühikutes U/mg. See on reaktsioonikiirus jagatuna olemasoleva ensüümivalgu kogusega.
• Diagramm reaktsioonikiiruse kohta sõltuvalt substraadi kontsentratsioonist, näidates kõvera madalat, ülemineku- ja küllastunud osa. Sisestatud substraadi kontsentratsioonile vastav kiirus on diagrammil tähistatud.

Kuidas arvutada ensüümi aktiivsust

Michaelise–Menteni võrrand

Leonor Michaelis ja Maud Menten avaldasid selle mudeli 1913. See kirjeldab, kuidas ensüümi reaktsioonikiirus sõltub substraadi kontsentratsioonist:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = reaktsioonikiirus ehk kiirus antud substraadi kontsentratsiooni korral
• $V_{max}$ = maksimaalne kiirus ehk kiirus, kui ensüüm on substraadiga täielikult küllastunud
• $[S]$ = substraadi kontsentratsioon
• $K_m$ = Michaelise konstant: substraadi kontsentratsioon, mille korral kiirus on pool Vmax-ist

Eriaktiivsuse valem

Eriaktiivsus saadakse selle kiiruse jagamisel olemasoleva ensüümivalgu kogusega; tulemus on ühikutes milligrammi kohta (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Siin on $A$ eriaktiivsus ja $[E]$ ensüümi kontsentratsioon.

Üks ensüümiühik (U) on ensüümi kogus, mis muundab 1 mikromooli (µmol) substraati minutis. Selle määratluse kehtestas Rahvusvaheline Biokeemia ja Molekulaarbioloogia Liit (IUBMB).

Ühikute seos on järgmine. Michaelise–Menteni võrrandis on kiiruse ühik substraadi kontsentratsioon jagatud ajaga. Kalkulaator kasutab [S] ja Km-i ühikutes mM, seega on Vmax-i ja v ühikud µmol minutis milliliitri kohta, kujul µmol/(min·mL). See on sama mis mM/min ja sama mis U/mL. Ensüümi kontsentratsiooni [E] ühik on mg/mL. Jagamisel milliliitrid taanduvad:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax-is on „minutis” juba olemas, seega ei kuulu eraldi ajategur valemisse.

See arvutus eeldab, et mõõdetud kiirus on algkiirus, mis määratakse reaktsiooni alguses, enne substraadi väheseks jäämist või produkti ensüümi pärssima hakkamist. Laborites mõõdetakse lineaarsesse vahemikku jäämiseks tavaliselt substraadi muundumise esimest 5–10%.

Näidisarvutus

Näide 1. Ensüümi kontsentratsioon 1 mg/mL, substraadi kontsentratsioon 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). Need on väärtused, millega kalkulaator alustab.

Kiirus = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Eriaktiivsus = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Näide 2. Samad tingimused, kuid ensüümi kontsentratsioon on kahekordistunud väärtuseni 2 mg/mL.

Kiirus = 33,33 µmol/(min·mL), muutumatu, sest kiirus ei sõltu selles võrrandis väärtusest [E]. Eriaktiivsus = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Ensüümi koguse kahekordistamine vähendab eriaktiivsuse poole võrra, sest sama kogukiirus jaguneb nüüd kaks korda suurema valgukoguse vahel.

Näide 3. Substraadi kontsentratsioon on tõstetud väärtuseni 100 mM, mis on Km-ist palju suurem; ensüümi kontsentratsioon on 1 mg/mL, Km 5 mM ja Vmax 50 µmol/(min·mL).

Kiirus = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Eriaktiivsus = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Suure substraadi kontsentratsiooni korral on ensüüm peaaegu küllastunud, mistõttu on kiirus Vmax-i lähedal.

Näide 4. Substraadi kontsentratsioon on vähendatud väärtuseni 1 mM, mis on Km-ist väiksem; ensüümi kontsentratsioon on 1 mg/mL, Km 5 mM ja Vmax 50 µmol/(min·mL).

Kiirus = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Eriaktiivsus = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Km-ist väiksema kontsentratsiooni korral piirab reaktsiooni substraadi vähesus, mistõttu jäävad nii kiirus kui ka eriaktiivsus Vmax-ist palju väiksemaks.

Põhiparameetrite selgitus

Ensüümi kontsentratsioon [E] on ensüümivalgu mass ruumalaühiku kohta, ühikuga mg/mL. Suurem väärtus jaotab sama reaktsioonikiiruse suurema valgukoguse vahel, vähendades eriaktiivsust. Ensüümi toimivust näitab toores kontsentratsiooniarvust paremini eriaktiivsus.

Substraadi kontsentratsioon [S] näitab ensüümi käsutuses oleva substraadi kogust, tavaliselt ühikutes mM. Väikese [S] korral suurendavad väikesed lisakogused kiirust järsult. Küllastuse lähedal annab täiendav substraat vähe juurde.

Michaelise konstant (Km) on substraadi kontsentratsioon, mille korral kiirus võrdub poolega Vmax-ist. Väike Km tähendab, et ensüüm saavutab poole maksimaalsest kiirusest väikese substraadi kontsentratsiooni juures, mis viitab ensüümi ja substraadi tugevale seondumisele. Näiteks on heksokinaasi Km glükoosi suhtes ligikaudu 0,1 mM, mis näitab suurt afiinsust.

Maksimaalne kiirus (Vmax) on kiirus, kui substraat ei piira enam reaktsiooni. Sisestage see ühikutes µmol/(min·mL), mis on sama mis mM/min või U/mL, et see sobiks [S] ja Km-i puhul kasutatavate mM-ühikutega. See sõltub ensüümi kogusest ja sellest, kui kiiresti suudab iga ensüümi molekul substraati muundada ehk milline on selle katalüütiline ringluskäik (kcat).

Reaktsiooniaeg on aeg, mille jooksul analüüs toimus. See aitab katse kavandamisel, sest liiga kaua kestnud reaktsioon võib substraadi ammendada ja muuta reaktsiooni mittelineaarseks. See ei kuulu eriaktiivsuse valemisse.

Kiiruse kõvera lugemine

Diagrammil on Michaelise–Menteni võrrandi abil kujutatud kiiruse sõltuvus substraadi kontsentratsioonist.

• Alla Km-i: kiirus suureneb ligikaudu võrdeliselt substraadi kontsentratsiooniga. Väikesed vead substraadi kontsentratsioonis põhjustavad tulemuses suuri vigu.
• Km-i lähedal: kõver paindub. Kiirus on pool Vmax-ist.
• Üle Km-i: kõver lameneb. Täiendav substraat suurendab kiirust vaid veidi, sest ensüüm on peaaegu küllastunud.

Miks eriaktiivsus on oluline

Eriaktiivsus on ensüümi puhtuse ja kvaliteedi standardne mõõt. Puhastamise ajal jälgivad teadlased seda igas etapis: töötlemata rakuekstrakti eriaktiivsus võib olla mõni U/mg, väga puhta proovi oma aga sadu või tuhandeid U/mg. Eriaktiivsuse suurenemine puhastusprotsessi käigus näitab, et inaktiivne valk eemaldatakse ja huvipakkuv ensüüm säilib.

Sama mõõtmine toetab ravimite väljatöötamist, mille käigus uurijad katsetavad, kuidas kandidaatühendid ensüümi aktiivsust vähendavad, ning kliinilist diagnostikat, kus arstid mõõdavad veres selliseid ensüüme nagu ALT ja AST maksakahjustuse tuvastamiseks.

Korduma kippuvad küsimused

Kuidas arvutada ensüümi aktiivsust Km-i ja Vmax-i põhjal? Esmalt leidke Michaelise–Menteni võrrandi abil reaktsioonikiirus, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Seejärel jagage see ensüümi kontsentratsiooniga, et saada eriaktiivsus ühikutes U/mg: aktiivsus = v / [E]. Hoidke Vmax ühikutes µmol/(min·mL) ja [E] ühikutes mg/mL, et ühikud taanduksid kujule U/mg.

Mis on ensüümi aktiivsuse ühik (U)? Üks ühik on ensüümi kogus, mis muundab määratud tingimustel 1 µmol substraati minutis, nagu määratleb IUBMB.

Miks ei sisalda valem reaktsiooniaega? Vmax on juba väljendatud kogusena minuti kohta, seega on see kiirus, mitte kogusumma. Selle uuesti ajaga jagamine arvestaks sama tegurit kaks korda ja muudaks tulemuse sõltuvaks analüüsi kestusest, kuigi see ei tohiks ensüümi omaduse puhul nii olla.

Miks eriaktiivsus ensüümi kontsentratsiooni suurenemisel väheneb? Michaelise–Menteni võrrandi kiirus ei sõltu ensüümi kontsentratsioonist. Eriaktiivsus jagab selle kindla kiiruse väärtusega [E], mistõttu suurem [E] annab väiksema tulemuse. Eri kontsentratsioonidega ensüümipreparaatide õiglaseks võrdlemiseks võrreldakse eriaktiivsust, mitte toorkiirust.

Mida tähendab väike Km? Väike Km tähendab, et ensüüm saavutab poole maksimaalsest kiirusest väikese substraadi kontsentratsiooni juures, mis näitab ensüümi ja substraadi tugevat seondumist.

Kas eriaktiivsus võib olla negatiivne? Ei. Negatiivne tulemus viitab sisendiveale, näiteks negatiivsele kontsentratsioonile, või arvutusveale, mitte tegelikule ensüüdimõõtmisele.

Viited

1. Michaelis, L. ja Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L. ja Stryer, L. (2012). Biochemistry (7. väljaanne). W.H. Freeman and Company.
3. Rahvusvaheline Biokeemia ja Molekulaarbioloogia Liit (IUBMB). Enzyme Nomenclature. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. BRENDA ensüümide andmebaas. https://www.brenda-enzymes.org/