Valgu lahustuvuse kalkulaator - Tasuta pH ja temperatuuri tööriist

Valgu lahustuvuse kalkulaator hindab valgu suurimat kontsentratsiooni, mis jääb lahustis lahustunuks kindla pH, temperatuuri ja ioontugevuse korral. See teisendab põhikeemia üheks arvuks: valgu milligrammide arv lahusti milliliitri kohta.

Valgu lahustuvus on oluline biokeemias, ravimpreparaatide koostamisel ja toiduteaduses. Kui valk ei püsi lahustununa, moodustuvad agregaadid või valk sadestub, mistõttu võib katse ebaõnnestuda või ravimit ei saa süstida.

Kuidas arvutada valgu lahustuvust

Lahustuvus sõltub viiest tegurist: valgu isoelektrilisest punktist (pH, mille korral on valgu summaarne laeng null), sulamistemperatuurist (temperatuur, mille juures valk hakkab lahti voltuma), lahusti dielektrilisest läbitavusest (näitaja, kui hästi see eraldab laetud osakesi), lahuse pH-st ja ioontugevusest (näitaja, kui palju lahustunud soola leidub).

Kalkulaator lähtub iga valgu teadaolevast lahustuvusest vees kindlatel võrdlustingimustel: 25 °C, pH 7,0 ja ioontugevus 0,15 M (ligikaudu vere soolasisaldus). Seejärel korrutab ta võrdlusväärtuse nelja suhtarvuga, ühe iga muutunud tingimuse kohta.

Valgu lahustuvuse valem

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ on valgu teadaolev lahustuvus vees võrdlustingimustel, ühikuga mg/ml.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, kus $pI$ on valgu isoelektriline punkt. Lahustuvus on isoelektrilises punktis väikseim ja suureneb, kui pH sellest eemaldub, stabiliseerudes paari pH-ühiku piires.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, kus $I$ on ioontugevus moolides liitri kohta. Väikese soolasisalduse korral suurendab see liige lahustuvust veidi („sooldumine lahusesse“). Suure soolasisalduse korral vähendab see lahustuvust („väljasoolamine“).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, kus $T_m$ on valgu sulamistemperatuur ühikutes °C. Lahustuvus suureneb temperatuuri tõustes aeglaselt, kuid langeb järsult, kui temperatuur läheneb väärtusele $T_m$ ja valk hakkab lahti voltuma.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, kus $\varepsilon$ on lahusti dielektriline läbitavus. Vee dielektriline läbitavus on 78,4, seega on selle liikme väärtus vees 1. Lahustid, mis eraldavad laenguid veest vähem tõhusalt, näiteks etanool, vähendavad lahustuvust.

Kalkulaatori kasutatavad võrdlusväärtused

Lahustuvuse kategooriad

Näide: albumiin fosfaatpuhvris

Leidke albumiini lahustuvus fosfaatpuhvris temperatuuril 25 °C, pH 7,4 ja ioontugevuse korral 0,15 M.

Albumiini võrdlusväärtused on $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/ml ja $T_m = 63°C$. Fosfaatpuhvri dielektriline läbitavus on 76,0.

1. pH-liige: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Suhtarv: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Iooniliige: ioontugevus (0,15 M) võrdub võrdlusväärtusega, seega on suhtarv 1.
3. Temperatuuriliige: temperatuur (25 °C) võrdub võrdlustemperatuuriga, seega on suhtarv 1.
4. Lahustiliige: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Kalkulaatori tulemuseks on 492,12 mg/ml, mis kuulub kategooriasse „väga hästi lahustuv“.

Näide: madalal temperatuuril glütseroolis olev lüsosüüm

Leidke lüsosüümi lahustuvus glütseroolilahuses temperatuuril 4 °C, pH 5,0 ja ioontugevuse korral 0,1 M. Need tingimused sarnanevad ensüümi külmsäilitamise tingimustega.

Lüsosüümi võrdlusväärtused on $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/ml ja $T_m = 72°C$. Glütserooli dielektriline läbitavus on 42,5.

1. pH-liige: liikumine pH-lt 7,0 pH-le 5,0 (mõlemad jäävad pI-st 11,35 palju allapoole) muudab pH-liiget vaid veidi. Suhtarv: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Iooniliige: ioontugevuse vähendamine väärtuselt 0,15 M väärtusele 0,1 M suurendab lahustuvust vähesel määral sissesoolamise toime tõttu. Suhtarv: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Temperatuuritegur: jahutamine temperatuurilt 25 °C temperatuurile 4 °C, mis jääb sulamistemperatuurist palju allapoole, vähendab teguri väärtust. Suhtarv: 0,8106.
4. Lahustiliige: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Kalkulaatori tulemuseks on 35,88 mg/ml, mis kuulub kategooriasse „lahustuv“. Tulemuse vähendab võrdlusväärtusest madal glütserooli dielektriline läbitavus, mitte külm temperatuur.

Kuidas kasutada valgu lahustuvuse kalkulaatorit

1. Valige loendist valk: albumiin, insuliin, lüsosüüm, hemoglobiin, müoglobiin, kollageen, kaseiin või fibrinogeen.
2. Valige lahusti: vesi, fosfaatpuhver, Tris-puhver, glütserool, DMSO, metanool, etanool või atsetoon.
3. Sisestage temperatuur ühikutes °C (0 kuni 100), pH (0 kuni 14) ja ioontugevus molaarsusena (0 kuni 2).
4. Vaadake arvutatud lahustuvust ühikutes mg/ml ja selle kategooriat. Tulemuse all olev riba näitab väärtust skaalal 0 kuni 100 mg/ml ning täitub täielikult väärtusel 100 mg/ml või sellest suurema väärtuse korral.

Mis mõjutab valgu lahustuvust

pH ja isoelektriline punkt. Igal valgul on isoelektriline punkt ehk pH, mille korral ei ole valgu pinnal summaarne elektrilaeng. Selle pH juures valgumolekulid üksteist ei tõrju, mistõttu kleepuvad need kokku ja sadestuvad lahusest kergemini. Kui pH nihkub isoelektrilisest punktist kummaski suunas eemale, tekib valgule summaarne laeng. Laetud molekulid tõrjuvad üksteist, mis hoiab neid eraldi ja lahustununa.

Ioontugevus. Lahustunud soola ioonid ümbritsevad valgu laetud pinnagruppe. Väikese kuni mõõduka kontsentratsiooni korral varjestavad need ioonid laenguid, mis muidu tõmbaksid kaks valgumolekuli kokku, suurendades nii lahustuvust. Seda nimetatakse sissesoolamiseks. Suure soolasisalduse korral konkureerivad ioonid valguga veemolekulide pärast ja eemaldavad veekihi, mis hoiab valku lahustununa. Seda nimetatakse väljasoolamiseks ning see on aluseks levinud puhastusmeetodile, milles kasutatakse valkude segust sadestamiseks ammooniumsulfaati.

Temperatuur. Lahuse soojendamine suurendab üldiselt lahustuvust teatud piirini. Valgu sulamistemperatuuri lähenedes hakkab valk lahti voltuma. Lahtivoltumine paljastab valgu hüdrofoobsed ehk vett tõrjuvad osad, mis on tavaliselt volditud struktuuri sees peidus. Need paljastunud osad kleepuvad üksteise külge ja põhjustavad agregeerumist, mistõttu langeb lahustuvus sulamistemperatuuri lähedal ja sellest kõrgemal järsult.

Lahusti. Lahusti dielektriline läbitavus näitab, kui tõhusalt see nõrgendab laetud osakeste vahelist elektrilist tõmmet. Vee dielektriline läbitavus on suur ja see eraldab laenguid hästi, mistõttu lahustub enamik valke vees paremini kui orgaanilistes lahustites, näiteks etanoolis või atsetoonis. Väikese dielektrilise läbitavusega lahustid võimaldavad eri valgumolekulide vastasmärgilistel laengutel tugevamini tõmbuda, soodustades agregeerumist.

Piirangud

Kalkulaator kasutab lihtsustatud mudelit, mis põhineb väikesel hulgal võrdlusvalkudel ja standardsetel lahustitel. See ei arvesta valgu puhtust, lisaaineid, näiteks detergente või stabilisaatoreid, ega ebatavalisi puhvri koostisosi. Tulemused on mõeldud katsete kavandamiseks ja on hinnangulised, mitte laboris lahustuvuse otsese mõõtmise asendus.

Korduma kippuvad küsimused

Mis on valgu lahustuvus? Valgu lahustuvus on valgu maksimaalne kontsentratsioon, mille korral valk jääb lahustis täielikult lahustunuks ega moodusta nähtavaid agregaate ega sadet.

Miks on valgu lahustuvus isoelektrilises punktis kõige väiksem? Isoelektrilises punktis puudub valgul summaarne elektrilaeng, mistõttu valgumolekulid ei tõrju üksteist enam elektriliselt. Selle tõrjumise puudumisel kleepuvad need tõenäolisemalt kokku ja sadestuvad lahusest välja.

Mis vahe on sissesoolamisel ja väljasoolamisel? Sissesoolamine toimub madala soolasisalduse korral, kui lahustunud ioonid varjestavad valgu laetud rühmi üksteise eest ja suurendavad lahustuvust. Väljasoolamine toimub suure soolasisalduse korral, kui ioonid eemaldavad valgu pinnalt vee ja vähendavad lahustuvust.

Kas kõrgem temperatuur suurendab alati lahustuvust? Ei. Lahustuvus suureneb temperatuuriga tavaliselt ainult teatud piirini. Kui temperatuur läheneb valgu sulamistemperatuurile, hakkab valk lahti voltuma, mis põhjustab tavaliselt agregeerumist ja lahustuvuse järsku vähenemist.

Miks lahustuvad valgud etanoolis või atsetoonis halvemini kui vees? Vee dielektriline läbitavus on suur, mis tähendab, et see nõrgendab valgumolekulide laetud osade vahelist elektrilist tõmmet väga tõhusalt. Etanooli ja atsetooni dielektriline läbitavus on väiksem, mistõttu eri valgumolekulide laetud rühmad tõmbuvad nendes lahustites tugevamini, muutes agregeerumise tõenäolisemaks.

Kui täpne see kalkulaator on? See annab füüsikalisel mudelil ning väikesel hulgal võrdlusvalkudel ja -lahustitel põhineva hinnangu. Kalkulaator aitab kitsendada katsetatavate tingimuste valikut, kuid konkreetse valguproovi lahustuvust saab kinnitada ainult eksperimentaalse mõõtmisega.

Lisalugemine

• Arakawa, T. ja Timasheff, S. N. (1984). Valkude lahusesse sooldumise ja väljasoolamise mehhanism kahevalentsete katioonide soolade toimel. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M. ja Pace, C. N. (2008). Valgu lahustuvuse mõõtmine ja suurendamine. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J. ja Edsall, J. T. (1943). Proteiinid, aminohapped ja peptiidid ioonide ja dipolaarsete ioonidena. Reinhold Publishing.