Entsyymien aktiivisuuden laskuri - Michaelis-Menten-kinetiikka

Entsyymiaktiivisuuslaskuri

Entsyymiaktiivisuuslaskuri määrittää, kuinka nopeasti entsyymi muuntaa substraatin tuotteeksi. Tulos ilmaistaan spesifisenä aktiivisuutena yksikköinä milligrammaa kohti (U/mg). Se käyttää Michaelis–Mentenin yhtälöä, entsyymikinetiikan vakiomallia, sekä näytteessä olevan entsyymiproteiinin määrää.

Entsyymit ovat proteiineja, jotka nopeuttavat kemiallisia reaktioita soluissa kulumatta itse. Tutkijat mittaavat entsyymin aktiivisuutta eri erien vertaamiseksi, puhdistusvaiheen toimivuuden tarkistamiseksi tai sen tutkimiseksi, miten lääke vaikuttaa entsyymin nopeuteen. Pelkkä entsyymipitoisuus ei kerro, toimiiko entsyymi tehtävänsä mukaisesti. Spesifinen aktiivisuus kertoo sen.

Mitä laskuri laskee

Työkalu käyttää viittä syöttöarvoa: entsyymipitoisuutta, substraattipitoisuutta, Michaelis-vakiota (Km), maksiminopeutta (Vmax) ja reaktioaikaa. Reaktioaika tallennetaan vertailua varten, mutta sitä ei käytetä kaavassa. Vmax on jo nopeus eli minuutissa muunnetun substraatin määrä, joten aika sisältyy siihen. Ajan jakaminen uudelleen laskisi sen kahdesti.

Laskuri antaa yhden luvun ja yhden kaavion:

• Spesifinen aktiivisuus, yksikköinä U/mg. Se on reaktionopeus jaettuna läsnä olevan entsyymiproteiinin määrällä.
• Kaavio reaktionopeudesta substraattipitoisuuden funktiona. Se näyttää käyrän matalan nopeuden, siirtymävaiheen ja saturoituneen osan. Syötettyä substraattipitoisuutta vastaava nopeus merkitään kaavioon.

Entsyymiaktiivisuuden laskeminen

Michaelis–Mentenin yhtälö

Leonor Michaelis ja Maud Menten julkaisivat tämän mallin vuonna 1913. Se kuvaa, miten entsyymin reaktionopeus riippuu substraattipitoisuudesta:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = reaktionopeus eli nopeus tietyllä substraattipitoisuudella
• $V_{max}$ = maksiminopeus eli nopeus, kun entsyymi on täysin substraatin saturoima
• $[S]$ = substraattipitoisuus
• $K_m$ = Michaelis-vakio eli substraattipitoisuus, jolla nopeus on puolet Vmax-arvosta

Spesifisen aktiivisuuden kaava

Spesifinen aktiivisuus saadaan jakamalla tämä nopeus läsnä olevan entsyymiproteiinin määrällä. Tulos ilmoitetaan yksikköinä milligrammaa kohti (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Tässä $A$ on spesifinen aktiivisuus ja $[E]$ entsyymipitoisuus.

Yksi entsyymiyksikkö (U) on entsyymin määrä, joka muuntaa 1 mikromoolin (µmol) substraattia minuutissa. Kansainvälinen biokemian ja molekyylibiologian liitto (IUBMB) on määritellyt tämän.

Yksiköt muodostuvat seuraavasti. Michaelis–Mentenin yhtälössä nopeuden yksikkö on substraattipitoisuus jaettuna ajalla. Laskuri käyttää [S]- ja Km-arvoja yksikössä mM, joten Vmax ja v ovat yksikössä µmol minuutissa millilitraa kohti, eli µmol/(min·mL). Se on sama kuin mM/min ja sama kuin U/mL. Entsyymipitoisuus [E] ilmoitetaan yksikössä mg/mL. Jakolaskussa millilitrat supistuvat pois:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax sisältää jo ”minuuttia kohti” -tekijän, joten kaavaan ei kuulu erillistä aika-termiä.

Tässä laskennassa oletetaan, että mitattu nopeus on alkunopeus, joka määritetään reaktion alkuvaiheessa ennen kuin substraatti vähenee liikaa tai tuote alkaa estää entsyymiä. Laboratorioissa mitataan tavallisesti ensimmäiset 5–10% substraatin muuntumisesta, jotta pysytään tällä lineaarisella alueella.

Laskuesimerkki

Esimerkki 1. Entsyymipitoisuus 1 mg/mL, substraattipitoisuus 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). Näillä arvoilla laskuri käynnistyy.

Nopeus = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Spesifinen aktiivisuus = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Esimerkki 2. Samat olosuhteet, mutta entsyymipitoisuus on kaksinkertaistettu arvoon 2 mg/mL.

Nopeus = 33,33 µmol/(min·mL), muuttumaton, koska nopeus ei tässä yhtälössä riipu arvosta [E]. Spesifinen aktiivisuus = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Entsyymin määrän kaksinkertaistaminen puolittaa spesifisen aktiivisuuden, koska sama kokonaisnopeus jaetaan nyt kaksinkertaisen proteiinimäärän kesken.

Esimerkki 3. Substraattipitoisuus nostetaan arvoon 100 mM, joka on selvästi Km-arvoa suurempi. Entsyymipitoisuus on 1 mg/mL, Km 5 mM ja Vmax 50 µmol/(min·mL).

Nopeus = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Spesifinen aktiivisuus = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Suurella substraattipitoisuudella entsyymi on lähes saturoitunut, joten nopeus on lähellä Vmax-arvoa.

Esimerkki 4. Substraattipitoisuus lasketaan arvoon 1 mM eli Km-arvon alapuolelle. Entsyymipitoisuus on 1 mg/mL, Km 5 mM ja Vmax 50 µmol/(min·mL).

Nopeus = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Spesifinen aktiivisuus = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Km-arvon alapuolella substraatin vähäinen määrä rajoittaa reaktiota, joten sekä nopeus että spesifinen aktiivisuus jäävät selvästi Vmax-arvon alapuolelle.

Keskeiset parametrit

Entsyymipitoisuus [E] on entsyymiproteiinin massa tilavuutta kohti, yksikkönä mg/mL. Suurempi arvo jakaa saman reaktionopeuden suuremman proteiinimäärän kesken ja pienentää spesifistä aktiivisuutta. Spesifinen aktiivisuus, ei pelkkä pitoisuus, osoittaa, toimiiko entsyymivalmiste hyvin.

Substraattipitoisuus [S] kertoo, kuinka paljon substraattia entsyymillä on käytettävissään, yleensä yksikkönä mM. Pienellä [S]-arvolla pienetkin lisäykset kasvattavat nopeutta jyrkästi. Lähellä saturaatiota lisäsubstraatti auttaa vain vähän.

Michaelis-vakio (Km) on substraattipitoisuus, jolla nopeus on puolet Vmax-arvosta. Pieni Km tarkoittaa, että entsyymi saavuttaa puolinopeuden pienellä substraattipitoisuudella, mikä osoittaa entsyymin ja substraatin sitoutuvan tiukasti. Esimerkiksi heksokinaasin Km glukoosille on noin 0,1 mM, mikä osoittaa suurta affiniteettia.

Maksiminopeus (Vmax) on nopeus, kun substraatti ei enää rajoita reaktiota. Syötä se yksikössä µmol/(min·mL), joka on sama kuin mM/min tai U/mL, jotta se vastaa [S]- ja Km-arvoissa käytettyä mM-yksikköä. Se riippuu entsyymin määrästä ja siitä, kuinka nopeasti kukin entsyymimolekyyli pystyy muuntamaan substraattia (sen katalyyttisestä vaihtoluvusta, kcat).

Reaktioaika on aika, jonka määritys kesti. Se auttaa kokeen suunnittelussa, koska liian pitkään jatkuva reaktio voi kuluttaa substraatin loppuun ja lakata käyttäytymästä lineaarisesti. Se ei itsessään kuulu spesifisen aktiivisuuden kaavaan.

Nopeuskäyrän tulkitseminen

Kaaviossa nopeus esitetään substraattipitoisuuden funktiona Michaelis–Mentenin yhtälön avulla.

• Km-arvon alapuolella: nopeus kasvaa suunnilleen samassa suhteessa kuin substraattipitoisuus. Pienet virheet substraattipitoisuudessa aiheuttavat suuria virheitä tulokseen.
• Km-arvon lähellä: käyrä kaartuu. Nopeus on puolet Vmax-arvosta.
• Km-arvon yläpuolella: käyrä tasaantuu. Lisäsubstraatti kasvattaa nopeutta vain vähän, koska entsyymi on lähes saturoitunut.

Miksi spesifinen aktiivisuus on tärkeä

Spesifinen aktiivisuus on entsyymin puhtauden ja laadun vakiintunut mittari. Puhdistuksen aikana tutkijat seuraavat sitä jokaisessa vaiheessa: raakasolu-uutteen spesifinen aktiivisuus voi olla muutama U/mg, kun taas erittäin puhdas näyte voi saavuttaa satoja tai tuhansia U/mg. Spesifisen aktiivisuuden kasvu puhdistusprosessin aikana osoittaa, että inaktiivista proteiinia poistuu samalla, kun haluttu entsyymi säilyy.

Sama mittaus tukee lääkekehitystä, jossa tutkijat testaavat, miten ehdokasyhdisteet vähentävät entsyymin aktiivisuutta, sekä kliinistä diagnostiikkaa, jossa lääkärit mittaavat verestä ALT- ja AST-entsyymejä maksavaurion tarkistamiseksi.

Usein kysyttyä

Miten entsyymiaktiivisuus lasketaan Km- ja Vmax-arvoista? Laske ensin reaktionopeus Michaelis–Mentenin yhtälöllä, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Jaa tulos sitten entsyymipitoisuudella, jotta saat spesifisen aktiivisuuden yksikössä U/mg: aktiivisuus = v / [E]. Pidä Vmax yksikössä µmol/(min·mL) ja [E] yksikössä mg/mL, jotta yksiköt supistuvat muotoon U/mg.

Mikä on entsyymiaktiivisuuden yksikkö (U)? Yksi yksikkö on entsyymin määrä, joka muuntaa 1 µmol substraattia minuutissa ilmoitetuissa olosuhteissa IUBMB:n määritelmän mukaisesti.

Miksi kaavassa ei ole reaktioaikaa? Vmax ilmoitetaan jo määränä minuuttia kohti, joten se on nopeus eikä kokonaismäärä. Ajan jakaminen uudelleen laskisi sen kahdesti ja tekisi tuloksesta riippuvaisen määrityksen kestosta, vaikka tuloksen pitäisi kuvata itse entsyymin ominaisuutta.

Miksi spesifinen aktiivisuus pienenee entsyymipitoisuuden kasvaessa? Michaelis–Mentenin yhtälön nopeus ei riipu entsyymipitoisuudesta. Spesifinen aktiivisuus jakaa tämän vakionopeuden arvolla [E], joten suurempi [E] tuottaa pienemmän tuloksen. Eri pitoisuuksisten entsyymivalmisteiden oikeudenmukainen vertailu tehdään vertaamalla spesifistä aktiivisuutta, ei pelkkää nopeutta.

Mitä pieni Km tarkoittaa? Pieni Km tarkoittaa, että entsyymi saavuttaa maksiminopeutensa puolikkaan pienellä substraattipitoisuudella, mikä osoittaa entsyymin ja substraatin sitoutuvan tiukasti.

Voiko spesifinen aktiivisuus olla negatiivinen? Ei. Negatiivinen tulos viittaa syöttövirheeseen, kuten negatiiviseen pitoisuuteen, tai laskuvirheeseen, ei todelliseen entsyymimittaukseen.

Lähteet

1. Michaelis, L., & Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2012). Biochemistry (7. painos). W.H. Freeman and Company.
3. International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Enzyme Nomenclature. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. BRENDA Enzyme Database. https://www.brenda-enzymes.org/