Proteiinipitoisuuden Laskuri | A280 mg/mL:ksi

Proteiinipitoisuuslaskuri

Proteiinipitoisuuslaskuri muuntaa spektrofotometrillä mitatun valon absorbanssilukeman liuokseen liuenneen proteiinin määräksi. Tulos ilmoitetaan yleensä milligrammoina millilitrassa (mg/mL) tai mikrogrammoina millilitrassa (μg/mL). Laskenta perustuu Beer–Lambertin lakiin, joka on kemian yhteys, jossa näytteen absorboiman valon määrä yhdistetään sen sisältämän aineen määrään.

Miten proteiinipitoisuus mitataan

Useimmat proteiinit absorboivat ultraviolettivaloa voimakkaasti aallonpituudella 280 nanometriä (nm). Tämä absorptio johtuu pääasiassa kahdesta proteiinin rakenteessa esiintyvästä aminohaposta, tryptofaanista ja tyrosiinista. Spektrofotometri ohjaa valoa näytteen läpi ja mittaa, kuinka paljon näyte absorboi sitä. Tätä lukemaa kutsutaan absorbanssiksi tai A280:ksi, kun mittaus tehdään aallonpituudella 280 nm.

Absorbanssin mittaaminen aallonpituudella 280 nm on nopeaa eikä tuhoa näytettä. Tämä erottaa menetelmän jäljempänä kuvatuista kemiallisista menetelmistä, kuten Bradford- ja BCA-määrityksistä. Menetelmä toimii parhaiten puhdistetulle liuoksessa olevalle proteiinille, jonka absorbanssilukema on noin 0,1–1,0. Tämän alueen ulkopuoliset lukemat ovat epäluotettavampia, joten näyte on usein laimennettava ennen mittausta.

Proteiinipitoisuuden kaava

Laskuri järjestää Beer–Lambertin lain uudelleen pitoisuuden ratkaisemiseksi:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — proteiinipitoisuus yksikkönä mg/mL
• A — absorbanssi aallonpituudella 280 nm (paljas luku ilman yksikköä)
• DF — laimennuskerroin eli kuinka monta kertaa alkuperäinen näyte laimennettiin ennen mittausta
• ε — ekstinktiokerroin, proteiinikohtainen vakio yksikkönä L/(g·cm)
• l — optinen matka eli etäisyys, jonka valo kulkee näytteen läpi, yksikkönä cm (tavallisessa kyvetissä yleensä 1 cm; kyvetti on pieni spektrofotometrissä käytettävä lasi- tai muoviastia)

Tulos muunnetaan mikrogrammoiksi millilitrassa kertomalla mg/mL-arvo luvulla 1 000. Näytteen proteiinin kokonaismassa saadaan kertomalla pitoisuus näytteen tilavuudella millilitroina.

Laskuesimerkki

Näytteen absorbanssilukema on 0,5 aallonpituudella 280 nm. Näytettä ei laimennettu, joten laimennuskerroin on 1, ja mittaus tehtiin tavallisessa 1 cm kyvetissä. Proteiini on naudan seerumin albumiini (BSA), jonka ekstinktiokerroin on 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

1 mL:n näytteessä tämä vastaa noin 0,75 mg proteiinia yhteensä eli 750 μg/mL.

Tavallisten proteiinien ekstinktiokertoimet

Kukin proteiini absorboi valoa eri tavoin, koska tryptofaani- ja tyrosiinitähteiden määrä vaihtelee proteiineittain. Ekstinktiokerroin kuvaa tätä tietyn proteiinin osalta aallonpituudella 280 nm yksiköissä L/(g·cm). Yleisesti käytettyjä arvoja ovat:

Laskuriin voi syöttää myös mukautetun ekstinktiokertoimen proteiinille, jota ei ole tässä luettelossa. Proteiinille, jonka aminohapposekvenssi tunnetaan, arvo voidaan arvioida Gillin ja von Hippelin vuonna 1989 julkaiseman kaavan avulla: ε₂₈₀ = (tryptofaanitähteet × 5 500) + (tyrosiinitähteet × 1 490) + (kystiinitähteet × 125). Kaavan tulos ilmoitetaan yksikössä M⁻¹cm⁻¹, joka on ainemääräpohjainen yksikkö ja eroaa edellä esitetyistä massapohjaisista L/(g·cm)-arvoista. Ilmaiset työkalut, kuten ExPASy-palvelimen ylläpitämä ProtParam, laskevat tämän arvon suoraan proteiinisekvenssistä.

Optinen matka ja laimennuskerroin

Optinen matka on näytteen sisältävän kyvetin leveys senttimetreinä mitattuna. Tavalliset kyvetit ovat leveydeltään 1 cm. Mikromääräspektrofotometreissä, joilla mitataan hyvin pieniä näytteitä, voidaan käyttää paljon lyhyempää optista matkaa, esimerkiksi 0,1 cm.

Laimennuskerroin ottaa huomioon ennen mittausta tehdyn laimennuksen. Jos väkevöity näyte antaisi absorbanssiksi yli 1,0, se laimennetaan yleensä ensin puskuriliuoksella. Laimennuskerroin on laimennetun kokonaismäärän ja alkuperäisen näytemäärän osamäärä. Esimerkiksi 10 μL:n näytteen sekoittaminen 990 μL:aan puskuriliuosta antaa kokonaistilavuudeksi 1 000 μL ja laimennuskertoimeksi 100.

Muita tapoja mitata proteiinipitoisuus

Absorbanssi aallonpituudella 280 nm on yksi useista laboratoriossa yleisesti käytetyistä menetelmistä.

• Bradford-määritys: käyttää väriainetta, joka vaihtaa väriä sitoutuessaan proteiiniin. Se toimii hyvin puhdistamattomilla näytteillä, mutta värinmuutos voi vaihdella eri proteiinien välillä.
• BCA-määritys: perustuu proteiinin peptidisidosten aiheuttamaan värinmuutokseen. Menetelmä sopii yhteen monien detergenttien kanssa, mutta sen suorittaminen kestää kauemmin kuin suoran absorbanssin mittaaminen.
• Lowryn menetelmä: vanhempi menetelmä, joka on erittäin herkkä mutta reagoi huonosti joidenkin tavallisten puskurin ainesosien kanssa.

Kaikki nämä kolme menetelmää tuhoavat näytteen. Suora A280-mittaus ei tuhoa näytettä, joten sama näyte voidaan ottaa talteen ja käyttää uudelleen.

Usein kysyttyä

Mikä on tämän menetelmän ihanteellinen absorbanssialue?

0,1:n ja 1,0:n välillä. Alle 0,1 lukema on epätarkka. Yli 1,0 absorbanssin ja pitoisuuden välinen yhteys ei ehkä enää ole lineaarinen, joten näyte pitäisi laimentaa ensin.

Miksi mitataan aallonpituudella 280 nm eikä 260 nm?

Nukleiinihapot, kuten DNA ja RNA, absorboivat voimakkaasti aallonpituudella 260 nm. Proteiinit absorboivat enemmän aallonpituudella 280 nm tryptofaani- ja tyrosiinipitoisuutensa vuoksi. Mittaaminen aallonpituudella 280 nm vähentää näytteessä mahdollisesti olevien nukleiinihappojen aiheuttamaa häiriötä.

Miten ekstinktiokerroin määritetään proteiinille, jota ei ole luettelossa?

Jos proteiinin sekvenssi tunnetaan, esimerkiksi ProtParam-työkalu laskee ekstinktiokertoimen tryptofaani-, tyrosiini- ja kystiinitähteiden määrän perusteella. Se voidaan myös mitata suoraan vertaamalla näytteen absorbanssia liuokseen, jonka pitoisuus tunnetaan.

Toimiiko tämä menetelmä proteiiniseokselle?

Se toimii parhaiten yksittäiselle, puhdistetulle proteiinille, jonka ekstinktiokerroin tunnetaan. Tuntemattomien proteiinien seos, kuten solulysaatti, mitataan yleensä sen sijaan Bradford- tai BCA-määrityksellä, koska näillä menetelmillä saadaan yhdenmukaisempi arvio proteiinin kokonaismäärästä.

Voivatko detergentit häiritä mittausta?

Kyllä. Monet detergentit absorboivat valoa lähellä aallonpituutta 280 nm, mikä voi vääristää tulosta. Saman detergenttipitoisuuden sisältävän nollanäytteen käyttö auttaa vähentämään tämän tausta-absorbanssin vaikutusta. Hyvin suuret detergenttipitoisuudet voivat edellyttää detergenttien kanssa yhteensopivaa määritystä, kuten BCA-määritystä.