Beer-Lambertin laki -laskuri - Laske absorptanssi välittömästi

Mikä on Beer–Lambertin laki?

Beer–Lambertin laki on kaava, joka kuvaa, kuinka paljon liuos absorboi valoa. Se yhdistää absorbanssin kolmeen tekijään: liuoksen pitoisuuteen, liuenneen aineen valonabsorptiokykyyn ja matkaan, jonka valo kulkee näytteen läpi. Lakia kutsutaan myös Beerin laiksi. Beer–Lambertin lain laskin käyttää tätä kaavaa absorbanssin, transmitanssin ja absorboituneen valon prosenttiosuuden määrittämiseen muutaman yksinkertaisen lähtöarvon perusteella.

Laki on spektroskopian keskeinen työkalu. Spektroskopiassa tutkitaan, miten aine absorboi ja emittoi valoa. Lakia käytetään päivittäin kemian, biologian ja lääketieteen laboratorioissa aineiden pitoisuuksien mittaamiseen liuoksesta.

Beer–Lambertin lain kaava

Beer–Lambertin lain mukaan:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A on absorbanssi eli valon määrä, jonka liuos absorboi tietyllä aallonpituudella. Sillä ei ole yksikköä.
• ε (epsilon) on molaarinen absorptiivisuus, josta käytetään myös nimitystä molaarinen ekstinktiokerroin. Se mittaa, kuinka voimakkaasti aine absorboi valoa tietyllä aallonpituudella. Yksikkö: L/(mol·cm).
• c on aineen pitoisuus yksikkönä mol/L (molaarisuus).
• l on valon kulkema matka eli etäisyys, jonka valo kulkee näytteen läpi, yksikkönä cm.

Absorbanssi ja transmitanssi liittyvät toisiinsa: transmitanssi on näytteen läpäisevän valon osuus:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

Tässä T on transmitanssi, luku 0:n ja 1:n välillä. Kun T kerrotaan luvulla 100, saadaan läpäisseen valon prosenttiosuus. Absorboituneen valon prosenttiosuus on:

$\text{Absorboitunut prosenttiosuus} = (1 - T) \times 100\%$

Esimerkiksi absorbanssi 1,0 tarkoittaa, että T = 0,1, joten 90 % valosta absorboitui. Absorbanssi 2,0 tarkoittaa, että T = 0,01, joten 99 % valosta absorboitui.

Absorbanssin laskeminen

Absorbanssi lasketaan syöttämällä laskimeen kolme arvoa:

1. Optinen matka (l) — näyteastian, yleensä kyvetin, leveys. Useimpien vakiokyvet­tien leveys on 1 cm, mutta joidenkin erikoiskyvettien leveys on 0,1 cm tai 10 cm.
2. Molaarinen absorptiivisuus (ε) — tietyn aineen ominaisuus tietyllä aallonpituudella. Se löytyy yleensä julkaistuista viitetaulukoista tai lasketaan molekyylin rakenteen perusteella. Esimerkiksi proteiinit absorboivat valoa noin 280 nm:n aallonpituudella kahden aminohapon, tryptofaanin ja tyrosiinin, vuoksi, ja tarkka arvo riippuu siitä, kuinka paljon näitä aminohappoja proteiini sisältää.
3. Pitoisuus (c) — liuenneen aineen määrä yksikkönä mol/L. Muissa yksiköissä, kuten mg/mL, ilmoitetut pitoisuudet on ensin muunnettava käyttäen molekyylin moolimassaa.

Laskin kertoo absorbanssin kertomalla kolme lukua keskenään ja määrittää sen jälkeen tuloksesta transmitanssin ja absorboituneen prosenttiosuuden.

Laskuesimerkki

Tutkija puhdistaa proteiinia ja haluaa tarkistaa sen pitoisuuden ennen kokeen suorittamista. Proteiinin molaarinen absorptiivisuus aallonpituudella 280 nm tunnetaan sen sekvenssin perusteella: ε = 44 000 L/(mol·cm). Tutkija mittaa näytteen standardikyvetissä, jonka optinen matka on 1 cm, ja saa absorbanssiksi A = 0,523.

Kun kaava järjestetään pitoisuuden ratkaisemista varten:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

Se on 11,9 mikromoolia litrassa (μM). Arvo on alueella, jolla mittalaitteet toimivat tarkimmin, joten tutkija voi luottaa tulokseen laimentamatta näytettä enempää.

Absorbanssiarvojen tulkinta

• A = 0: tällä aallonpituudella ei absorboidu valoa.
• A = 0,3–0,9: alue, jolla useimmat spektrofotometrit antavat tarkimmat ja lineaarisimmat lukemat.
• A = 1,0: 90 % valosta absorboituu ja 10 % läpäisee näytteen.
• A = 2,0: 99 % valosta absorboituu ja 1 % läpäisee näytteen.
• A yli arvon 2,5: useimpien mittalaitteiden luotettavan mittausalueen ulkopuolella. Näyte on laimennettava ja mitattava uudelleen.

Noin 0,3:n alittaviin lukemiin vaikuttaa mittalaitteen kohina. Noin 1,5:n ylittäviin lukemiin vaikuttaa mittalaitteen sisäinen hajavalo, joka aiheuttaa virhettä. Näytteen laimentaminen ja uudelleenmittaus on vakiomenetelmä, kun lukema jää tarkan mittausalueen ulkopuolelle.

Beer–Lambertin lain käyttökohteet

Analyyttinen kemia. Laboratorioissa mitataan näytteen absorbanssi ja kaavan avulla lasketaan tuntematon pitoisuus. Menetelmää käytetään yleisesti veden nitraatti-, fosfaatti- ja metalli-ionipitoisuuksien määrittämiseen sekä kemikaalierän pitoisuuden tarkistamiseen tuotannossa.

Biokemia. Absorbanssin mittaaminen aallonpituudella 280 nm antaa arvion proteiinipitoisuudesta. Absorbanssin mittaaminen aallonpituudella 260 nm antaa arvion DNA- tai RNA-pitoisuudesta; vakiintuneen käytännön mukaan absorbanssi 1,0 vastaa noin 50 μg/mL kaksijuosteista DNA:ta tai 40 μg/mL RNA:ta. Kahden mittaustuloksen suhde (A260/A280) antaa karkean arvion näytteen puhtaudesta.

Lääketeollisuus. Lääkevalmistajat käyttävät absorbanssimittauksia testatakseen, kuinka nopeasti tabletti vapauttaa vaikuttavan aineensa, sekä seuratakseen lääkkeen hajoamista varastoinnin aikana.

Lääketiede. Monet automaattiset verianalysaattorit mittaavat väriä muuttavista kemiallisista reaktioista syntyvää absorbanssia ja ilmoittavat glukoosi-, maksaentsyymi- ja bilirubiiniarvot.

Elintarvikkeet ja juomat. Oluen väri mitataan absorbanssina aallonpituudella 430 nm European Brewery Conventionin (EBC) menetelmällä. Samankaltaisilla menetelmillä tarkistetaan viinien ja virvoitusjuomien väri.

Beer–Lambertin lain rajoitukset

Laki olettaa, että valo on yksittäisen tarkasti määritetyn aallonpituuden valoa ja että näyte ei sirotta valoa. Se ei päde kunnolla muutamissa yleisissä tilanteissa:

• Suuri pitoisuus. Kun pitoisuus ylittää noin 0,01 mol/L, liuenneet molekyylit alkavat olla vuorovaikutuksessa keskenään, eikä absorbanssi enää kasva pitoisuuden mukana lineaarisesti.
• Sameat tai hiukkasia sisältävät näytteet. Suspensiot ja sameat nesteet sirottavat valoa absorboimisen lisäksi, mikä suurentaa mitattua absorbanssia. Beer–Lambertin laki ei huomioi sirontaa; Kubelka–Munkin teoreettista mallia käytetään opaakeille tai valoa sirottaville näytteille, kuten jauheille.
• Mittauksen aikana tapahtuvat kemialliset muutokset. Jotkin aineet hajoavat valossa tai niiden ominaisuudet muuttuvat pH:n vaikutuksesta mittauksen aikana, mikä muuttaa lukemaa kesken mittauksen.
• Lämpötilan muutokset. Molaarinen absorptiivisuus riippuu lämpötilasta, joten eri lämpötiloissa otetut lukemat eivät ole suoraan vertailukelpoisia.

Historia

Laki kehittyi yli vuosisadan aikana kolmen tutkijan työn tuloksena. Pierre Bouguer kuvasi vuonna 1729, että jokainen samanpaksuinen materiaalikerros absorboi yhtä suuren osuuden sen läpi kulkevasta valosta. Johann Heinrich Lambert esitti tämän suhteen uudelleen matemaattisesti vuonna 1760 julkaistussa teoksessaan Photometria ja osoitti, että absorbanssi kasvaa suoraan verrannollisesti optiseen matkaan. August Beer laajensi lakia vuonna 1852 osoittamalla, että absorbanssi kasvaa suoraan verrannollisesti myös pitoisuuteen. Yhdistettyä lakia kutsutaan joskus kaikkien kolmen tutkijan mukaan Bouguer’n–Beerin–Lambertin laiksi.

Usein kysyttyä

Mihin Beer–Lambertin lakia käytetään? Se laskee, kuinka paljon liuos absorboi valoa, ja sen avulla voidaan käänteisesti määrittää tuntematon pitoisuus mitatusta absorbanssista. Siksi se on UV-Vis-spektrofotometrian perusta. UV-Vis-spektrofotometria on yleinen laboratoriomenetelmä liuoksessa olevan aineen määrän mittaamiseen.

Mitä yksiköitä Beer–Lambertin laki käyttää? Optinen matka ilmoitetaan senttimetreinä, molaarinen absorptiivisuus yksikössä L/(mol·cm) ja pitoisuus yksikössä mol/L. Absorbanssilla ei itsessään ole yksikköä, vaikka sen yhteydessä käytetään joskus merkintää ”AU” (absorbanssiyksikkö). Muiden yksiköiden sijoittaminen kaavaan ilman muuntamista antaa väärän tuloksen.

Miksi absorbanssilukemani ei ole verrannollinen pitoisuuteen? Yleisimmät syyt ovat noin 0,01 mol/L:n ylittävä pitoisuus, samea tai hiukkasia sisältävä näyte tai lukema, joka on kaukana alueelta 0,3–0,9, jolla mittalaitteet toimivat tarkimmin. Näytteen laimentaminen ja uudelleenmittaus osoittaa yleensä, mikä syy on kyseessä.

Mitä eroa on absorbanssilla ja transmitanssilla? Transmitanssi on näytteen läpi kulkevan valon osuus. Absorbanssi on transmitanssin negatiivinen 10-kantainen logaritmi: A = −log₁₀(T). Absorbanssin kasvaessa transmitanssi pienenee.

Mitä eroa on absorbanssilla ja optisella tiheydellä? Ne tarkoittavat samaa suuretta. Termiä ”optinen tiheys” käytetään useammin biologiassa, kun taas ”absorbanssi” on yleisempi kemiassa.

Mikä absorbanssialue on tarkin? Noin 0,3–0,9. Tämän alueen alapuolella mittalaitteen kohina peittää signaalin. Noin 1,5:n yläpuolella mittalaitteen sisäinen hajavalo aiheuttaa virhettä, ja noin 2,5:n yläpuolella useimmat mittalaitteet eivät pysty antamaan lainkaan luotettavaa lukemaa.

Lähteet

1. Beer, A. (1852). ”Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten.” Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. Swinehart, D. F. (1962). ”The Beer-Lambert Law.” Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S. & Popp, J. (2020). ”The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure.” ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.