Proteiinin Liukoisuuslaskuri - Ilmainen pH & Lämpötila-Työkalu

Proteiinien liukoisuuslaskuri arvioi suurimman proteiinipitoisuuden, joka pysyy liuenneena liuottimessa tietyllä pH-arvolla, lämpötilalla ja ionivahvuudella. Se muuntaa kemian perusteet yhdeksi luvuksi: proteiinimilligrammoiksi liuotinmillilitraa kohti.

Proteiinien liukoisuudella on merkitystä biokemiassa, lääkkeiden formuloinnissa ja elintarviketieteessä. Proteiini, joka ei pysy liuenneena, muodostaa aggregaatteja tai saostumia, mikä voi pilata kokeen tai tehdä lääkkeen injektoinnista mahdotonta.

Proteiinien liukoisuuden laskeminen

Liukoisuus riippuu viidestä tekijästä: proteiinin isoelektrisestä pisteestä (pH-arvosta, jossa sen nettovaraus on nolla), sulamislämpötilasta (lämpötilasta, jossa sen rakenne alkaa avautua), liuottimen dielektrisyysvakiosta (mitta siitä, kuinka hyvin se erottaa varautuneita hiukkasia), liuoksen pH-arvosta ja ionivahvuudesta (mitta liuenneen suolan määrästä).

Laskuri käyttää lähtökohtana kunkin proteiinin tunnettua liukoisuutta vedessä tietyissä vertailuolosuhteissa: 25 °C, pH 7,0 ja ionivahvuus 0,15 M (suunnilleen veren suolapitoisuus). Sen jälkeen se kertoo vertailuarvon neljällä suhteella, yhden kutakin muuttunutta olosuhdetta kohti.

Proteiinien liukoisuuden kaava

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ on proteiinin tunnettu liukoisuus vedessä vertailuolosuhteissa, yksikkönä mg/ml.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, jossa $pI$ on proteiinin isoelektrinen piste. Liukoisuus on pienimmillään isoelektrisessä pisteessä ja kasvaa pH-arvon siirtyessä siitä poispäin, kunnes se tasaantuu muutaman pH-yksikön sisällä.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, jossa $I$ on ionivahvuus mooleina litraa kohti. Pienillä suolapitoisuuksilla tämä termi lisää liukoisuutta hieman (suolaantuminen). Suurilla suolapitoisuuksilla se vähentää liukoisuutta (ulos suolaaminen).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, jossa $T_m$ on proteiinin sulamispiste °C:na. Liukoisuus kasvaa lämpötilan mukana hitaasti ja laskee sitten jyrkästi, kun lämpötila lähestyy arvoa $T_m$ ja proteiini alkaa avautua.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, jossa $\varepsilon$ on liuottimen dielektrisyysvakio. Veden dielektrisyysvakio on 78,4, joten tämä termi on vedessä 1. Vettä heikommin varauksia erottavat liuottimet, kuten etanoli, pienentävät liukoisuutta.

Laskurin käyttämät vertailuarvot

Liukoisuusluokat

Esimerkki: albumiini fosfaattipuskurissa

Selvitetään albumiinin liukoisuus fosfaattipuskurissa lämpötilassa 25 °C, pH-arvolla 7,4 ja ionivahvuudella 0,15 M.

Albumiinin vertailuarvot ovat $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/ml ja $T_m = 63°C$. Fosfaattipuskurin dielektrisyysvakio on 76,0.

1. pH-termi: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Suhde: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Ionitermi: ionivahvuus (0,15 M) on sama kuin vertailuarvo, joten suhde on 1.
3. Lämpötilatermi: lämpötila (25 °C) on sama kuin vertailuarvo, joten suhde on 1.
4. Liuotintermi: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/ml}$

Laskurin tulos on 492,12 mg/ml, mikä kuuluu ”erittäin liukenevien” luokkaan.

Esimerkki: lysotsyymi glyserolissa matalassa lämpötilassa

Selvitetään lysotsyymin liukoisuus glyseroliliuoksessa lämpötilassa 4 °C, pH-arvolla 5,0 ja ionivahvuudella 0,1 M. Nämä olosuhteet vastaavat entsyymin kylmäsäilytystä.

Lysotsyymin vertailuarvot ovat $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/ml ja $T_m = 72°C$. Glyserolin dielektrisyysvakio on 42,5.

1. pH-termi: siirtyminen pH-arvosta 7,0 pH-arvoon 5,0 (molemmat selvästi proteiinin pI-arvon 11,35 alapuolella) muuttaa pH-termiä vain vähän. Suhde: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Ionitermi: ionivahvuuden pienentäminen arvosta 0,15 M arvoon 0,1 M suurentaa liukoisuutta hieman liukoisuutta lisäävän suolaantumisen vaikutuksesta. Suhde: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Lämpötilatermi: jäähdyttäminen lämpötilasta 25 °C lämpötilaan 4 °C, selvästi sulamispisteen alapuolelle, pienentää termiä. Suhde: 0,8106.
4. Liuotintermi: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/ml}$

Laskurin tulos on 35,88 mg/ml, mikä kuuluu ”liukenevien” luokkaan. Glyserolin pieni dielektrisyysvakio, ei kylmä lämpötila, pienentää tulosta vertailuarvosta.

Proteiinien liukoisuuslaskurin käyttö

1. Valitse luettelosta proteiini: albumiini, insuliini, lysotsyymi, hemoglobiini, myoglobiini, kollageeni, kaseiini tai fibrinogeeni.
2. Valitse liuotin: vesi, fosfaattipuskuri, Tris-puskuri, glyseroli, DMSO, metanoli, etanoli tai asetoni.
3. Syötä lämpötila °C:na (0–100), pH-arvo (0–14) ja ionivahvuus mooleina litrassa (0–2).
4. Lue laskettu liukoisuus mg/ml-yksikköinä ja sen luokka. Tuloksen alapuolella oleva palkki näyttää arvon asteikolla 0–100 mg/ml ja täyttyy kokonaan arvolla 100 mg/ml tai sitä suuremmilla arvoilla.

Proteiinien liukoisuuteen vaikuttavat tekijät

pH ja isoelektrinen piste. Jokaisella proteiinilla on isoelektrinen piste eli pH-arvo, jossa sen pinnalla ei ole sähkövarausten nettomäärää. Tässä pH-arvossa proteiinimolekyylit eivät hylji toisiaan, joten ne kasautuvat yhteen ja saostuvat liuoksesta helpommin. Kun pH-arvoa siirretään isoelektrisestä pisteestä kumpaan tahansa suuntaan, proteiini saa nettovarauksen. Varautuneet molekyylit hylkivät toisiaan, mikä pitää ne erillään ja liuenneina.

Ionivahvuus. Liuenneet suolaionit ympäröivät proteiinin varautuneita pintaryhmiä. Pienillä ja kohtalaisilla pitoisuuksilla nämä ionit suojaavat varauksia, jotka muuten vetäisivät kaksi proteiinimolekyyliä yhteen, ja suurentavat siten liukoisuutta. Tätä kutsutaan suolaantumiseksi. Suurilla suolapitoisuuksilla ionit kilpailevat proteiinin kanssa vesimolekyyleistä ja irrottavat proteiinin liuenneena pitävän vesikerroksen. Tätä kutsutaan ulos suolaamiseksi, ja siihen perustuu yleinen puhdistusmenetelmä, jossa ammoniumsulfaattia käytetään saostamaan proteiineja seoksesta.

Lämpötila. Liuoksen lämmittäminen yleensä suurentaa liukoisuutta tiettyyn rajaan asti. Kun lämpötila lähestyy proteiinin sulamispistettä, proteiini alkaa avautua. Avautuminen paljastaa proteiinin hydrofobisia eli vettä hylkiviä osia, jotka ovat tavallisesti piilossa sen laskostuneessa rakenteessa. Paljastuneet osat tarttuvat toisiinsa ja aiheuttavat aggregoitumista, joten liukoisuus laskee jyrkästi lähellä sulamispistettä ja sen yläpuolella.

Liuotin. Liuottimen dielektrisyysvakio mittaa, kuinka tehokkaasti se heikentää varautuneiden hiukkasten välistä sähköistä vetovoimaa. Vedellä on suuri dielektrisyysvakio, ja se erottaa varauksia tehokkaasti. Siksi useimmat proteiinit liukenevat veteen paremmin kuin orgaanisiin liuottimiin, kuten etanoliin tai asetoniin. Liuottimet, joiden dielektrisyysvakio on pieni, antavat eri proteiinimolekyylien vastakkaisten varausten vetää toisiaan voimakkaammin, mikä edistää aggregoitumista.

Rajoitteet

Laskuri käyttää yksinkertaistettua mallia, joka perustuu pieneen joukkoon vertailuproteiineja ja tavallisia liuottimia. Se ei huomioi proteiinin puhtautta, lisäaineita, kuten detergenttejä tai stabilointiaineita, eikä poikkeavia puskurikomponentteja. Tulokset ovat kokeiden suunnittelua varten tehtyjä arvioita, eivät korvaa liukoisuuden suoraa mittaamista laboratoriossa.

Usein kysyttyä

Mitä proteiinien liukoisuus tarkoittaa? Proteiinien liukoisuus on proteiinin suurin pitoisuus, joka pysyy täysin liuenneena liuottimessa muodostamatta näkyviä aggregaatteja tai saostumaa.

Miksi proteiini liukenee heikoimmin isoelektrisessä pisteessään? Isoelektrisessä pisteessä proteiinilla ei ole sähkövarausten nettomäärää, joten proteiinimolekyylit eivät enää hylji toisiaan sähköisesti. Ilman tätä hylkimistä ne tarttuvat toisiinsa todennäköisemmin ja poistuvat liuoksesta.

Mikä ero on liukoisuutta lisäävällä suolavaikutuksella ja ulossuolaantumisella? Liukoisuutta lisäävä suolavaikutus ilmenee pienillä suolapitoisuuksilla, jolloin liuenneet ionit suojaavat proteiinin varautuneita ryhmiä toisiltaan ja suurentavat liukoisuutta. Ulos suolaantuminen tapahtuu suurilla suolapitoisuuksilla, jolloin ionit irrottavat vettä proteiinin pinnalta ja pienentävät liukoisuutta.

Suurentaako korkeampi lämpötila aina liukoisuutta? Ei. Liukoisuus yleensä kasvaa lämpötilan mukana vain tiettyyn rajaan asti. Kun lämpötila lähestyy proteiinin sulamispistettä, proteiini alkaa avautua, mikä yleensä aiheuttaa aggregoitumista ja liukoisuuden jyrkän laskun.

Miksi proteiinit liukenevat etanoliin tai asetoniin heikommin kuin veteen? Veden dielektrisyysvakio on suuri, mikä tarkoittaa, että vesi heikentää proteiinimolekyylien varautuneiden osien välistä sähköistä vetovoimaa erittäin tehokkaasti. Etanolin ja asetonin dielektrisyysvakiot ovat pienempiä, joten eri proteiinimolekyylien varautuneet ryhmät vetävät näissä liuottimissa toisiaan voimakkaammin, mikä edistää aggregoitumista.

Kuinka tarkka tämä laskuri on? Se antaa fyysiseen malliin sekä pieneen joukkoon vertailuproteiineja ja liuottimia perustuvan arvion. Se auttaa rajaamaan testattavia olosuhteita, mutta kokeellinen mittaus on ainoa tapa varmistaa tietyn proteiininäytteen liukoisuus.

Lisätietoa

• Arakawa, T. ja Timasheff, S. N. (1984). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M. ja Pace, C. N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J. ja Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.