חשב נפחי דגימה מדויקים בהתבסס על קריאות ספיגת BCA ומסת החלבון הרצויה. חיוני להעמסה עקבית של חלבון בבלוטים מערביים וביישומים מעבדתיים אחרים.
כלי זה מחשב את נפח הדגימה הנדרש על בסיס תוצאות הספיגה של BCA ומסת הדגימה. הזן את ערך הספיגה ומסת הדגימה עבור כל דגימה כדי לחשב את נפח הדגימה המתאים.
נפח הדגימה מחושב באמצעות הנוסחה הבאה:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
מחשבון נפח דגימה של BCA הוא כלי מיוחד שנועד לעזור לחוקרים וטכנאי מעבדה לקבוע במדויק את נפח הדגימה המתאים לניסויים בהתבסס על תוצאות בדיקת BCA (חומצה ביסינכונינית). מחשבון זה לוקח את קריאות הספיגה מהבדיקה שלך ואת מסה הדגימה הרצויה כדי לחשב את הנפח המדויק הנדרש לטעינה עקבית של חלבונים ביישומים כמו ווסטרן בלוטינג, ניסויים אנזימטיים וטכניקות ניתוח חלבונים אחרות.
בדיקת BCA היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לכימות חלבונים במעבדות ביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. על ידי מדידת הספיגה של דגימות החלבון שלך והשוואתן לעקומת סטנדרט, תוכל לקבוע את ריכוז החלבון בדיוק גבוה. המחשבון שלנו מפשט את התהליך הזה על ידי המרת קריאות הספיגה אוטומטית לנפחי דגימה מדויקים הנדרשים לניסויים שלך.
בדיקת החומצה הביסינכונינית (BCA) היא בדיקה ביוכימית לקביעת הריכוז הכולל של חלבון בפתרון. העיקרון של בדיקה זו מתבסס על היווצרות קומפלקס Cu²⁺-חלבון בתנאים אלקליניים, ולאחר מכן הפחתת Cu²⁺ ל-Cu¹⁺. כמות ההפחתה היא פרופורציונלית לחלבון הנוכח. BCA יוצרת קומפלקס בצבע סגול עם Cu¹⁺ בסביבות אלקליניות, מה שמספק בסיס לניטור ההפחתה של הנחושת על ידי חלבונים.
עוצמת הצבע הסגול עולה פרופורציונלית לריכוז החלבון, שניתן למדוד באמצעות ספקטרופוטומטר ב-562 ננומטר. קריאות הספיגה מושוות לאחר מכן לעקומת סטנדרט כדי לקבוע את ריכוז החלבון בדגימות לא ידועות.
הנוסחה הבסיסית לחישוב נפח הדגימה מתוצאות הספיגה של BCA היא:
איפה:
ריכוז החלבון מחושב מקריאת הספיגה באמצעות נוסחת עקומת הסטנדרט:
עבור בדיקת BCA סטנדרטית, השיפוע הטיפוסי הוא בערך 2.0, והחיתוך לרוב קרוב לאפס, אם כי ערכים אלה עשויים להשתנות בהתאם לתנאי הבדיקה הספציפיים שלך ועקומת הסטנדרט.
המחשבון שלנו מפשט את התהליך של קביעת נפחי דגימה מתוצאות בדיקת BCA. עקוב אחרי הצעדים הבאים כדי לקבל חישובים מדויקים:
הזן מידע על הדגימה:
בחר סוג עקומת סטנדרט:
צפה בתוצאות:
העתק או ייצא תוצאות:
בואו נעבור על דוגמה מעשית:
זה אומר שעליך לטעון 13.33 μL מהדגימה שלך כדי לקבל 20 μg של חלבון.
המחשבון מספק מספר פרטי מידע חשובים:
ריכוז חלבון: זה מחושב מקריאת הספיגה שלך באמצעות עקומת הסטנדרט שנבחרה. הוא מייצג את כמות החלבון לכל יחידת נפח בדגימה שלך (μg/μL).
נפח דגימה: זהו הנפח של הדגימה שלך שמכילה את כמות החלבון הרצויה שלך. ערך זה הוא מה שתשתמש בו כאשר תכין את ניסוייך.
אזהרות והמלצות: המחשבון עשוי לספק אזהרות עבור:
אחת מהיישומים הנפוצים ביותר עבור המחשבון הזה היא הכנת דגימות עבור ווסטרן בלוטינג. טעינה עקבית של חלבונים היא קריטית עבור תוצאות אמינות של ווסטרן בלוט, והמחשבון הזה מבטיח שתטעין את אותה כמות חלבון עבור כל דגימה, גם כאשר ריכוזיהם שונים.
זרימת עבודה לדוגמה:
בניסויים אנזימטיים, לעיתים קרובות יש צורך להשתמש בכמות ספציפית של חלבון כדי לסטנדרטיזציה של תנאי התגובה בין דגימות שונות או ניסויים.
זרימת עבודה לדוגמה:
בניסויים של אימונופרציפיטציה (IP), חשוב להתחיל עם כמות חלבון עקבית כדי להשוות תוצאות בין תנאים שונים.
זרימת עבודה לדוגמה:
במהלך טיהור חלבונים, לעיתים קרובות יש צורך לעקוב אחרי ריכוז החלבון ולחשב את התשואות בשלבים שונים.
זרימת עבודה לדוגמה:
בעוד שהמחשבון מספק פרמטרים ברירת מחדל עבור בדיקות BCA סטנדרטיות, תוכל גם להזין ערכים מותאמים אישית אם יצרת עקומת סטנדרט משלך. זה מועיל במיוחד כאשר:
כדי להשתמש בעקומת סטנדרט מותאמת אישית:
המחשבון מאפשר לך להוסיף דגימות מרובות ולחשב את הנפחים שלהן בו זמנית. זה מועיל במיוחד כאשר מכינים דגימות לניסויים שדורשים טעינה עקבית של חלבון בין תנאים שונים.
יתרונות של עיבוד קבוצתי:
אם קריאת הספיגה שלך גבוהה מ-2.0, היא עשויה להיות מחוץ לטווח הליניארי של בדיקת ה-BCA. במקרה כזה:
עבור קריאות ספיגה מתחת ל-0.1, ייתכן שאתה קרוב לגבול הגילוי של הבדיקה, מה שעשוי להשפיע על הדיוק. שקול:
אם המחשבון מציע נפח שהוא גדול מדי עבור היישום שלך:
הכימות המדויק של חלבונים היה דרישה בסיסית בביוכימיה ובביולוגיה מולקולרית מאז שהתחומים הללו צצו. שיטות מוקדמות התבססו על קביעת תוכן חנקן, שהייתה גוזלת זמן ודורשת ציוד מיוחד.
שיטת קיידלה (1883): אחת השיטות הראשונות לכימות חלבונים, המתבססת על מדידת תוכן החנקן.
בדיקת ביורט (תחילת המאה ה-20): שיטה זו מתבססת על התגובה בין קשרי פפטיד ליון נחושת בתמיסה אלקלינית, המייצרת צבע סגול.
בדיקת לורי (1951): פותחה על ידי אוליבר לורי, שיטה זו שילבה את תגובת הביורט עם ריאגנט פולין-צ'וקלטו, והגדילה את הרגישות.
בדיקת ברדפורד (1976): מריון ברדפורד פיתחה שיטה זו באמצעות צבע קואומסיה בריליאנט בלו G-250, הקושר חלבונים ומעביר את מקסימום הספיגה.
בדיקת BCA (1985): פותחה על ידי פול סמית וצוותו בחברת פירס כימיקל, שיטה זו שילבה את תגובת הביורט עם גילוי BCA, והציעה רגישות משופרת והתאמה טובה יותר עם דטרגנטים.
בדיקת BCA תוארה לראשונה במאמר מ-1985 על ידי סמית ואחרים שכותרתו "Measurement of protein using bicinchoninic acid." היא פותחה כדי להתמודד עם המגבלות של השיטות הקיימות, במיוחד ההפרעה מחומרים שונים הנמצאים בדרך כלל בשימוש בהפקת חלבונים וטיהור.
החדשנות המרכזית הייתה השימוש בחומצה ביסינכונינית לגילוי יוני Cu¹⁺ המיוצרים על ידי הפחתת Cu²⁺ על ידי חלבונים, מה שיוצר קומפלקס בצבע סגול שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית. זה סיפק מספר יתרונות:
מאז השקת הבדיקה, בדיקת BCA הפכה לאחת משיטות כימות החלבונים הנפוצות ביותר במעבדות ביוכימיה וביולוגיה מולקולרית ברחבי העולם.
1=IF(B2<=0,"שגיאה: ספיגה לא חוקית",IF(C2<=0,"שגיאה: מסה לא חוקית",C2/(2*B2)))
2
3' היכן ש:
4' B2 מכילה את קריאת הספיגה
5' C2 מכילה את מסת הדגימה הרצויה בμg
6' הנוסחה מחזירה את נפח הדגימה הנדרש בμL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """חשב את ריכוז החלבון מתוך ספיגה באמצעות עקומת סטנדרט."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("ספיגה לא יכולה להיות שלילית")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """חשב את נפח הדגימה הנדרש בהתבסס על ספיגה ומסה רצויה."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("מסת הדגימה חייבת להיות חיובית")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("ריכוז החלבון המחושב חייב להיות חיובי")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# דוגמת שימוש
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"עבור ספיגה {absorbance} ומסה רצויה של חלבון {sample_mass} μg:")
31 print(f"ריכוז חלבון: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"נפח דגימה נדרש: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"שגיאה: {e}")
351# פונקציה לחישוב ריכוז חלבון מתוך ספיגה
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("ספיגה לא יכולה להיות שלילית")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# פונקציה לחישוב נפח דגימה
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("מסת הדגימה חייבת להיות חיובית")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("ריכוז החלבון המחושב חייב להיות חיובי")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# דוגמת שימוש
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("עבור ספיגה %.2f ומסה רצויה של חלבון %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("ריכוז חלבון: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("נפח דגימה נדרש: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("שגיאה: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("ספיגה לא יכולה להיות שלילית");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("מסת הדגימה חייבת להיות חיובית");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("ריכוז החלבון המחושב חייב להיות חיובי");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// דוגמת שימוש
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`עבור ספיגה ${absorbance} ומסה רצויה של חלבון ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`ריכוז חלבון: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`נפח דגימה נדרש: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`שגיאה: ${error.message}`);
37}
38הקשר בין ספיגה לריכוז חלבון הוא בדרך כלל ליניארי בטווח מסוים. להלן ויזואליזציה של עקומת BCA סטנדרטית:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
שיטות כימות חלבונים שונות מציעות יתרונות ומגבלות שונות. להלן כיצד בדיקת BCA משווה לשיטות אחרות נפוצות:
| שיטה | טווח רגישות | יתרונות | מגבלות | הכי טוב עבור |
|---|---|---|---|---|
| בדיקת BCA | 5-2000 μg/mL | • מתאימה לדטרגנטים • פחות שונות בין חלבונים • יציבות פיתוח צבע | • מושפעת מחומרים מחזרים • מושפעת מחלק מהחומרים הקושרים | • כימות חלבונים כללי • דגימות המכילות דטרגנטים |
| בדיקת ברדפורד | 1-1500 μg/mL | • מהירה (2-5 דקות) • מעט חומרים מפריעים | • שונות גבוהה בין חלבונים • לא מתאימה לדטרגנטים | • מדידות מהירות • דגימות ללא דטרגנטים |
| שיטת לורי | 1-1500 μg/mL | • מבוססת היטב • רגישות טובה | • חומרים מפריעים רבים • מספר שלבים | • עקביות היסטורית • דגימות חלבון טהור |
| ספיגת UV (280 ננומטר) | 20-3000 μg/mL | • לא הרסנית • מאוד מהירה • ללא צורך בריאגנטים | • מושפעת מחומצות גרעין • דורשת דגימות טהורות | • פתרונות חלבון טהורים • בדיקות מהירות במהלך טיהור |
| פלורומטרי | 0.1-500 μg/mL | • הרגישות הגבוהה ביותר • טווח דינמי רחב | • ריאגנטים יקרים • דורש פלורומטר | • דגימות מדוללות מאוד • נפח דגימה מוגבל |
בדיקת BCA (חומצה ביסינכונינית) משמשת בעיקר לכימות הריכוז הכולל של חלבון בדגימה. היא בשימוש נרחב בביוכימיה, ביולוגיה תאית וביולוגיה מולקולרית עבור יישומים כמו ווסטרן בלוטינג, ניסויים אנזימטיים, אימונופרציפיטציה וטיהור חלבונים.
בדיקת BCA מדויקת בדרך כלל בטווח של 5-10% כאשר היא מתבצעת כראוי. הדיוק שלה תלוי במספר גורמים כולל איכות עקומת הסטנדרט, היעדר חומרים מפריעים, והאם הרכב החלבון הלא ידוע דומה לחלבון הסטנדרט שבו השתמשת.
מספר חומרים יכולים להפריע לתוצאות בדיקת BCA, כולל:
ההבדלים העיקריים הם:
אם המחשבון שלך מציג נפח גדול מאוד, זה בדרך כלל מצביע על ריכוז חלבון נמוך בדגימה שלך. זה יכול להיות בגלל:
שקול לרכז את הדגימה שלך או להתאים את העיצוב הניסויי שלך כדי להתחשב בריכוז החלבון הנמוך יותר.
המחשבון הזה מיועד במיוחד לתוצאות בדיקת BCA. בעוד שהעיקרון הבסיסי (המרת ריכוז לנפח) חל על שיטות אחרות, הקשר בין ספיגה לריכוז חלבון משתנה בין בדיקות שונות. עבור שיטות אחרות כמו ברדפורד או לורי, תצטרך להשתמש בפרמטרים שונים של עקומת הסטנדרט.
עבור קריאות ספיגה מחוץ לטווח הליניארי (בדרך כלל >2.0):
חלבון הסרום הבקרי (BSA) הוא הסטנדרט הנפוץ ביותר עבור בדיקות BCA מכיוון שהוא:
עם זאת, אם הדגימות שלך מכילות חלבון דומיננטי השונה באופן משמעותי מ-BSA, שקול להשתמש בחלבון זה כסטנדרט שלך עבור תוצאות מדויקות יותר.
הצבע הסגול המפותח בתגובה של BCA יציב במשך מספר שעות בטמפרטורת החדר וניתן למדוד אותו בכל עת במהלך התקופה הזו. עם זאת, עבור תוצאות הטובות ביותר, מומלץ למדוד את כל הסטנדרטים והדגימות באותו זמן בערך לאחר פיתוח הצבע.
בעוד שניתן טכנית להשתמש בעקומת סטנדרט קודמת, לא מומלץ לעשות זאת עבור כימות מדויק. שינויים בריאגנטים, תנאי אינקובציה וכיול מכשירים יכולים להשפיע על הקשר בין ספיגה לריכוז חלבון. עבור תוצאות אמינות, יש ליצור עקומת סטנדרט חדשה בכל פעם שאתה מבצע את הבדיקה.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." הוראות. זמין ב: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
עכשיו כשאתה מבין את העקרונות מאחורי כימות חלבונים של BCA וחישוב נפח הדגימה, נסה את המחשבון שלנו כדי לפשט את זרימת העבודה במעבדה שלך. פשוט הזן את קריאות הספיגה שלך ואת מסת הדגימה הרצויה כדי לקבל חישובי נפח דגימה מדויקים ומיידיים.
בין אם אתה מכין דגימות עבור ווסטרן בלוטינג, ניסויים אנזימטיים או כל ניסוי אחר המבוסס על חלבונים, המחשבון שלנו יעזור להבטיח תוצאות עקביות ואמינות. חסוך זמן, הפחת שגיאות ושפר את השחזור של ניסוייך עם מחשבון נפח דגימה של BCA Absorbance.
גלה עוד כלים שעשויים להיות שימושיים עבור זרימת העבודה שלך