דלג לתוכן
🛠️
Whiz Tools

מחשבון נפח BCA | כלי כימות חלבונים

מחשבון נפח BCA מחשב את נפח הדגימה לפי קריאת בליעה בבדיקת BCA, ומספק נפחי טעינת חלבון מדויקים לבלוטים מערביים ולבדיקות אנזימים. כלי חינמי לביוכימיה ולמעבדות.

מחשבון נפח דגימה של BCA לספיגה

חשב נפחי דגימות מדויקים מקריאות ספיגה של BCA ומסת חלבון מטרה. הזן ערכי ספיגה וכמויות חלבון רצויות כדי לקבל נפחים מדויקים לטעינה עקבית.

תצורת עקומה סטנדרטית

סוג עקומה סטנדרטית
עקומת BCA Standard
ויזואליזציה של עקומת BCA Standard0.0000.5001.0001.5002.0002.500ריכוז חלבון (μg/μL)00.511.522.5ספיגה (A562)

קלט דגימות

דגימה 1

נפח דגימה
—μL

סיכום תוצאות

שם דגימהספיגהמסת דגימה (μg)ריכוז חלבון (μg/μL)נפח דגימה (μL)
דגימה 1————

נוסחת חישוב

נפח הדגימה מחושב באמצעות הנוסחה הבאה:

נפח דגימה (μL) = מסת דגימה (μg) / ריכוז חלבון (μg/μL)
טיפים לשימוש

• שמור על ספיגה בין 0.1-2.0 לקבלת תוצאות מדויקות בטווח הלינארי

• כמויות טיפוסיות: 20-50 μg לבלוט מערבי, 500-1000 μg להדבקה חיסונית

• נפחים מעל 1000 μL מצביעים על ריכוז חלבון נמוך - שקול לרכז את הדגימה

• BCA סטנדרטי מתאים למרבית היישומים (20-2000 μg/mL). השתמש בBCA משופר לדגימות מהולות (5-250 μg/mL)

מחשבון טעינה...
📚

תיעוד

מחשבון נפח BCA מהיר לכימות חלבונים

כאשר סיימת זה עתה לבצע בדיקת BCA וצריך לחשב כמה נפח דגימה להעמיס על הבלוט המערבי, אתה ניצב בפני חישוב פשוט בעיקרון אך מייגע במעשה. מדוד ספיגה ב-562 נמ, השווה לעקומת הסטנדרט שלך, חשב ריכוז חלבון, ולאחר מכן קבע את הנפח הנדרש למסת החלבון הרצויה.

מחשבון זה מבצע את החישוב המתמטי מיידית. הזן את קריאת הספיגה של BCA וכמות החלבון המטרה - תקבל את נפח הדגימה המדויק במיקרוליטרים. מה שהופך את בדיקות BCA למהימנות במיוחד הוא סבילותן לדטרגנטים וחומרי פני שטח שיפריעו לשיטות Bradford או Lowry. כאשר אתה עובד עם תמציות תאים המכילות SDS או Triton X-100, BCA נשאר מדויק בעוד שיטות אחרות נכשלות.

כיצד עובדת כימות חלבון BCA

עקרון בדיקת BCA

בדיקות BCA (חומצה ביצ'ינכונינית) פועלות דרך תגובת נחושת דו-שלבית. חלבונים מפחיתים Cu²⁺ ל-Cu¹⁺ בתנאים בסיסיים—כמות ההפחתה קשורה ישירות לריכוז החלבון. כאן נכנסת החומצה הביצ'ינכונינית: היא נקשרת עם Cu¹⁺ ויוצרת קומפלקס סגול עוצמתי הבולע אור ב-562 נמ.

אתה מודד את הצבע הסגול בספקטרופוטומטר. ככל שהסגול כהה יותר, כך יש יותר חלבון. השווה את הבליעה של הדגימה לעקומת סטנדרט (בדרך כלל עם תקני BSA), וכך תקבל את ריכוז החלבון. היופי של BCA הוא שהוא עובד באמינות גם כאשר דטרגנטים, סוכרים מפחיתים או רכיבי בופר נפוצים אחרים נוכחים—חומרים שהיו מפריעים לבדיקות Bradford או Lowry.

הנוסחה לחישוב נפח דגימה

הנוסחה הבסיסית לחישוב נפח דגימה מתוצאות בליעה של BCA היא:

נפח דגימה (μL)=מסת דגימה (μg)ריכוז חלבון (μg/μL)\text{נפח דגימה (μL)} = \frac{\text{מסת דגימה (μg)}}{\text{ריכוז חלבון (μg/μL)}}

כאשר:

  • נפח דגימה הוא הנפח הנדרש של דגימה (במיקרוליטרים, μL)
  • מסת דגימה היא כמות החלבון הרצויה לשימוש (במיקרוגרמים, μg)
  • ריכוז חלבון נגזר מקריאת הבליעה של BCA (ב-μg/μL)

ריכוז החלבון מחושב מקריאת הבליעה באמצעות משוואת עקומת סטנדרט:

\text{ריכוז חלבון (μg/μL)} = \text{שיפוע} \times \text{בליעה} + \text{חותך}}

עבור בדיקת BCA סטנדרטית, השיפוע הטיפוסי הוא כ-2.0, והחותך קרוב לאפס לעתים קרובות, אף כי ערכים אלה יכולים להשתנות בהתאם לתנאי הבדיקה ועקומת הסטנדרט שלכם. בהתאם לפרוטוקולי שיטות באנזימולוגיה, יצירת עקומת סטנדרט עם לפחות 5-6 נקודות המכסות את טווח הריכוז הצפוי מבטיחה כימות מדויק עבור סוגי חלבון שונים.

שימוש במחשבון נפח דגימה של BCA

המחשבון מפשט את מה שאחרת היה דורש חישוב ידני עבור כל דגימה:

  1. הזן את המדידות שלך:

    • תייג את הדגימה שלך (שימושי בעת חישוב נפחים עבור מספר דגימות בו-זמנית)
    • הזן את קריאת האבסורבציה מהספקטרופוטומטר שלך ב-562 נ"מ
    • ציין כמה חלבון אתה צריך במיקרוגרמים (בדרך כלל 10-50 μg לבלוט מערבי, 500-1000 μg להשקעה חיסונית)

  2. בחר סוג עקומת סטנדרט:

    • BCA סטנדרטי: הפרוטוקול הנפוץ ביותר, עובד בטווח של 20-2000 μg/mL
    • BCA משופר: רגישות גבוהה יותר עבור דגימות מהולות (5-250 μg/mL)
    • מיקרו BCA: פורמט מיקרוכרית כאשר נפח הדגימה מוגבל
    • מותאם אישית: הזן שיפוע וחותך משלך אם יצרת עקומת סטנדרט שונה

  3. קבל את נפח הדגימה שלך:

    • המחשבון מציג מיד כמה מיקרוליטרים עליך לפיפט
    • הוסף מספר דגימות כדי לחשב לוח שלם בבת אחת
    • העתק תוצאות ישירות למחברת המעבדה או למערכת LIMS

דוגמה מהעולם האמיתי

נניח שאתה מכין דגימות לבלוט מערבי המשווה ביטוי חלבוני בשש שורות תאים. אתה מריץ את בדיקת BCA והדגימה נותנת קריאת אבסורבציה של 0.75. אתה צריך 20 μg של חלבון לנתיב.

תוך שימוש בעקומת סטנדרט (שיפוע = 2.0, חותך = 0):

  • ריכוז חלבון = 2.0 × 0.75 + 0 = 1.5 μg/μL
  • נפח דגימה נדרש = 20 μg ÷ 1.5 μg/μL = 13.33 μL

פיפט 13.33 μL מדגימה זו, הוסף בופר טעינה, וקיבלת בדיוק 20 μg של חלבון. בינתיים, הדגימה שלך עם אבסורבציה של 1.2 תזדקק רק ל-8.33 μL עבור אותם 20 μg. המחשבון מבטל את הצורך לעבוד דרך חישוב זה עבור כל דגימה - פשוט הזן את הקריאות שלך וקבל את כל הנפחים בבת אחת.

הבנת התוצאות

המחשבון מספק מספר פרטים חשובים:

  1. ריכוז חלבון: זה מחושב מקריאת הבליעה שלכם באמצעות עקומת הסטנדרט הנבחרת. הוא מייצג את כמות החלבון ליחידת נפח בדגימה שלכם (μg/μL).

  2. נפח דגימה: זהו הנפח של הדגימה שלכם המכיל את כמות החלבון הרצויה. ערך זה הוא מה שתשתמשו בו בהכנת הניסויים שלכם.

  3. אזהרות והמלצות: המחשבון עשוי לספק אזהרות עבור:

    • קריאות בליעה גבוהות מאוד (>3.0) שעלולות להיות מחוץ לטווח הליניארי של הבדיקה
    • קריאות בליעה נמוכות מאוד (<0.1) שעלולות להיות קרובות לגבול הגילוי
    • נפחים מחושבים שהם גדולים מדי (>1000 μL) או קטנים מדי (<1 μL)

יישומים מעשיים במעבדה

הכנת דגימות בבלוט מערבי

אי-עקביות בטעינת חלבונים היא אחת הסיבות הנפוצות ביותר לכישלון בלוט מערבי בהשגת תוצאות מהימנות. ייתכן שתראה פסים חזקים בנתיב אחד ופסים דהויים באחר - לא בשל הבדלים ברמות ביטוי, אלא בשל טעינת כמויות שונות של חלבון כולל.

הפתרון פשוט אך דורש חישובי נפח מדויקים. לאחר שתקבל קריאות ספיגה BCA עבור כל הדגימות, קבע כמה חלבון לטעון בכל נתיב (אני בדרך כלל משתמש ב-20-30 מק"ג עבור חלבונים שכיחים, עד 50 מק"ג עבור מטרות פחות שכיחות). חשב את הנפח הנדרש לכל דגימה, ולאחר מכן יישר על ידי הבאת כל הדגימות לאותו נפח סופי עם בופר הפירוק לפני הוספת בופר לאמלי.

טעות נפוצה: שכחה שנפח הדגימה משתנה לאחר הוספת בופר הטעינה. אם אתה טוען 15 מק"ל בסך הכל ובופר הטעינה הוא פי 4, תזדקק ל-3.75 מק"ל בופר ו-11.25 מק"ל של דילול הדגימה. תכנן את הדילולים בהתאם.

בדיקות אנזימטיות

מדידות קינטיקה אנזימטית דורשות כמויות עקביות של חלבון בין חזרות ותנאים. בעת השוואת פעילות אנזימטית בין טיפולי תאים או דגימות רקמה שונות, עליך לדעת שאתה מתחיל עם אותה כמות חלבון כוללת - אחרת, הבדלים בפעילות יכולים לשקף פשוט הבדלים בריכוז האנזים.

עבור בדיקות אנזימטיות, אני בדרך כלל עובד עם כמויות חלבון נמוכות יותר מאשר בבלוט מערבי - לעתים קרובות 5-10 מק"ג לתגובה עבור אנזימים שכיחים. המפתח הוא לשמור על עקביות זו בכל התנאים ונקודות הזמן.

ניסויי השקעה חיסונית

ניסויי IP יכולים לצרוך כמויות משמעותיות של חלבון - בדרך כלל 500-1000 מק"ג של לייזט כולל לתגובה. כאשר אתה מפריד חלבון בעל שכיחות נמוכה או בודק נוגדנים מרובים, ייתכן שתעבד תריסר או יותר IP בניסוי אחד.

התחלה עם כמויות חלבון לא שוות מערערת את כל הניסוי. אם לדגימה אחת יש 800 מק"ג קלט ולאחרת יש 1200 מק"ג, לא תוכל להשוות באופן משמעותי את כמות החלבונים המשקעים. חשב את הנפח הנדרש לכל לייזט, יישר לאותו נפח כולל עם בופר הפירוק, ולאחר מכן המשך עם דגירת הנוגדן. זה מבטיח שהבדלים שאתה רואה בבלוט המערבי משקפים הבדלים ביולוגיים ממשיים, ולא שונות בחומר המוצא.

טיהור חלבונים

מעקב אחר ריכוז חלבון לאורך שלבי הטיהור הוא חיוני לחישוב תפוקות וקביעת אילו חלקים מכילים את החלבון המטרה שלך. בדרך כלל תבצע בדיקות BCA על חלקים מהעמודה כדי לזהות חלקים מרכזיים ולהעריך יעילות טיהור.

מה שמועיל כאן: חשב את סך החלבון בכל חלק (ריכוז × נפח) כדי לעקוב אחר השבה דרך תכנית הטיהור שלך. אם אתה מתחיל עם 500 מ"ג של חלבון כולל בלייזט ומסיים עם 2 מ"ג של חלבון מטוהר ב-95% טוהר, השבת 0.4% מהחלבון הכולל אך העשרת את המטרה שלך באופן משמעותי. חישובים אלה מנחים את האופטימיזציה של פרוטוקול הטיהור שלך.

תכונות מתקדמות ושיקולים

עקומות סטנדרט מותאמות אישית

בעוד שהמחשבון מספק פרמטרים ברירת מחדל לבדיקות BCA סטנדרטיות, תוכל גם להזין ערכים מותאמים אישית אם יצרת עקומת סטנדרט משלך. זה שימושי במיוחד כאשר:

  • עובדים עם דגימות חלבון לא סטנדרטיות
  • משתמשים בפרוטוקולי BCA מותאמים
  • עובדים בנוכחות חומרים שעלולים להפריע לבדיקה

כדי להשתמש בעקומת סטנדרט מותאמת אישית:

  1. בחר "מותאם אישית" מאפשרויות עקומת הסטנדרט
  2. הזן את ערכי השיפוע והחותך שלך
  3. המחשבון ישתמש בערכים אלה לכל החישובים העוקבים

טיפול במספר דגימות

המחשבון מאפשר לך להוסיף מספר דגימות ולחשב את נפחיהן בו-זמנית. זה שימושי במיוחד בהכנת דגימות לניסויים הדורשים טעינת חלבון עקבית בתנאים שונים.

יתרונות עיבוד אצווה:

  • חסוך זמן על ידי חישוב כל הנפחים בבת אחת
  • הבטח עקביות בכל הדגימות שלך
  • השווה בקלות ריכוזי חלבון בין דגימות
  • זהה חריגים או טעויות אפשריות במדידה

פתרון בעיות נפוצות

ספיגה מעל לטווח הליניארי

קריאות ספיגה מעל 2.0 נמצאות בדרך כלל מחוץ לטווח הליניארי של רוב עקומות הסטנדרט של BCA. תראה זאת בדגימות מרוכזות מאוד - חלבונים מטוהרים, תמציות גרעיניות או לייזטים שלא מהולו כראוי.

הפתרון פשוט: מהל את הדגימה פי 5 או פי 10 במים או בבופר לייזיס, בצע מחדש את בדיקת BCA והכפל את הריכוז המחושב בגורם הדילול. אל תנסה לחרוג מעבר לטווח הליניארי של עקומת הסטנדרט שלך - היחס בין ספיגה לריכוז מתפרק בריכוזים גבוהים, מה שמוביל לרמות חלבון מוערכות בחסר.

ספיגה נמוכה בקרבת גבולות הגילוי

כאשר הספיגה יורדת מתחת ל-0.1, דיוק המדידה הופך לבעייתי. אתה קרוב לגבול התחתון של הגילוי, שם שינויים קטנים בקריאת הספיגה מתורגמים להבדלים גדולים בריכוז המחושב.

עבור דגימות מהולות, שקול לעבור לפרוטוקולי BCA משופרים או מיקרו, המציעים רגישות טובה יותר. לחלופין, רכז את הדגימה באמצעות מסנני צנטריפוגה (אמיקון או דומים). כמוצא אחרון, התאם את עיצוב הניסוי לעבודה עם פחות חלבון - רבים מהיישומים סובלים מכמויות טעינה נמוכות מכפי שאתה עשוי לצפות.

חישובי נפח שאינם הגיוניים

המחשבון עשוי להגיד לך למזוג 150 מיקרוליטר כאשר קיבולת הבאר המרבית היא 30 מיקרוליטר. או שהוא מציע 0.8 מיקרוליטר, שהוא מתחת לטווח הפיפטציה המדויק של רוב המיקרופיפטות.

עבור נפחים גדולים: רכז את הדגימה באמצעות מסנני צנטריפוגה או שיטות משקע (TCA או משקע אצטון). עבור נפחים קטנים: מהל את הדגימה (ואז השתמש בנפח יחסית גדול יותר) או הפחת את כמות החלבון המטרה אם הניסוי שלך מאפשר זאת.

התפתחות שיטות לכימות חלבונים

כימות חלבונים עבר דרך ארוכה מאז שיטת קייל-דאל של 1883, אשר דרשה עיכול דגימות בחומצה גופרתית רותחת כדי למדוד תכולת חנקן. מעבדות נדרשו לציוד מתמחה ומומחיות ניכרת רק כדי להעריך ריכוז חלבונים.

כיצד הגענו לבדיקות BCA המודרניות

בדיקת ביורט (ראשית המאה ה-20) הביאה ניתוח צבעוני לכימות חלבונים. קשרי פפטיד מתקשרים עם יוני נחושת בתמיסה בסיסית, ויוצרים צבע סגול. פשוטה, אך לא במיוחד רגישה.

אוליבר לאורי שיפר זאת ב-1951 על ידי שילוב תגובת ביורט עם ריאגנט פולין-סיוקלטו. בדיקת לאורי שלטה בכימות חלבונים במשך עשורים, אך סבלה מחולשה קריטית: חומרים כימיים נפוצים במעבדה הפריעו לתגובה - דטרגנטים, EDTA, ואפילו ריכוזי מלח גבוהים יכלו לשבש את המדידות.

השיטה של מריון ברדפורד משנת 1976 שהשתמשה ב-כחול בריליאנט קומסי G-250 הציעה מהירות - תוצאות תוך 5 דקות במקום 30 - אך הציגה בעיות משלה. הצבע נקשר בהעדפה לחומצות אמינו בסיסיות, כך שהרכב החלבון משפיע דרמטית על הקריאות. באופן קריטי יותר, דטרגנטים בריכוזים המשמשים בפירוק תאים מפריעים לחלוטין לבדיקה.

הופעת בדיקת BCA ב-1985. פול סמית וחבריו בחברת פירס הבחינו שחומצה ביצ'ינכונינית יכולה לזהות יוני Cu¹⁺ ביתר רגישות מאשר ריאגנטים ביורט מסורתיים. החדשנות שלהם שילבה את הכימיה הסובלנית של ביורט למרכיבי בופר שונים עם רגישות מוגברת, ויצרה שיטה שעובדת באמינות גם בנוכחות דטרגנטים, סוכרים מחזרים וחומרים אחרים המפריעים לבדיקות ברדפורד או לאורי. זו הסיבה שבדיקת BCA הפכה לסטנדרט לכימות חלבונים מתאים תאיים - היא עובדת בתנאי דגימה אמיתיים.

דוגמאות קוד לחישוב נפח דגימה

נוסחת Excel

1=IF(B2<=0,"שגיאה: ספיגה לא תקינה",IF(C2<=0,"שגיאה: מסת דגימה לא תקינה",C2/(2*B2)))
2
3' היכן:
4' B2 מכיל את קריאת הספיגה
5' C2 מכיל את מסת הדגימה הרצויה ב-μg
6' הנוסחה מחזירה את נפח הדגימה הנדרש ב-μL
7

יישום Python

1import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5    """חישוב ריכוז חלבון מספיגה באמצעות עקומת סטנדרט."""
6    if absorbance < 0:
7        raise ValueError("ספיגה לא יכולה להיות שלילית")
8    return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11    """חישוב נפח דגימה נדרש על בסיס ספיגה ומסה רצויה."""
12    if sample_mass <= 0:
13        raise ValueError("מסת דגימה חייבת להיות חיובית")
14    
15    protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16    
17    if protein_concentration <= 0:
18        raise ValueError("ריכוז חלבון מחושב חייב להיות חיובי")
19    
20    return sample_mass / protein_concentration
21
22# שימוש לדוגמה
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20  # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29    volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30    print(f"עבור ספיגה {absorbance} ומסת חלבון רצויה {sample_mass} μg:")
31    print(f"ריכוז חלבון: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32    print(f"נפח דגימה נדרש: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34    print(f"שגיאה: {e}")
35

קוד R לניתוח

1# פונקציה לחישוב ריכוז חלבון מספיגה
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3  if (absorbance < 0) {
4    stop("ספיגה לא יכולה להיות שלילית")
5  }
6  return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# פונקציה לחישוב נפח דגימה
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11  if (sample_mass <= 0) {
12    stop("מסת דגימה חייבת להיות חיובית")
13  }
14  
15  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16  
17  if (protein_concentration <= 0) {
18    stop("ריכוז חלבון מחושב חייב להיות חיובי")
19  }
20  
21  return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# שימוש לדוגמה
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20  # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31  volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32  protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33  
34  cat(sprintf("עבור ספיגה %.2f ומסת חלבון רצויה %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35  cat(sprintf("ריכוז חלבון: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36  cat(sprintf("נפח דגימה נדרש: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38  cat(sprintf("שגיאה: %s\n", e$message))
39})
40

יישום JavaScript

1function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2  if (absorbance < 0) {
3    throw new Error("ספיגה לא יכולה להיות שלילית");
4  }
5  return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9  if (sampleMass <= 0) {
10    throw new Error("מסת דגימה חייבת להיות חיובית");
11  }
12  
13  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14  
15  if (proteinConcentration <= 0) {
16    throw new Error("ריכוז חלבון מחושב חייב להיות חיובי");
17  }
18  
19  return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// שימוש לדוגמה
23try {
24  const absorbance = 0.75;
25  const sampleMass = 20; // μg
26  const slope = 2.0;
27  const intercept = 0;
28  
29  const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30  const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31  
32  console.log(`עבור ספיגה ${absorbance} ומסת חלבון רצויה ${sampleMass} μg:`);
33  console.log(`ריכוז חלבון: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34  console.log(`נפח דגימה נדרש: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36  console.error(`שגיאה: ${error.message}`);
37}
38

חיזוי עקומת סטנדרט

היחס בין הספיגה לריכוז החלבון הוא לרוב לינארי בטווח מסוים. להלן חיזוי של עקומת BCA סטנדרטית:

עקומת BCA סטנדרטית לכימות חלבון חיזוי של היחס הלינארי בין ספיגה לריכוז חלבון בבדיקת BCA 0.0 
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>

<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
0.0 
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>

<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>

ספיגה (562 nm) ריכוז חלבון (μg/μL)

עקומת סטנדרט דגימות סטנדרט

עקומת BCA סטנדרטית

השוואה לשיטות אחרות של כימות חלבונים

שיטות שונות של כימות חלבונים מציגות יתרונות והגבלות שונות. להלן השוואה של בדיקת BCA לשיטות נפוצות אחרות:

שיטהטווח רגישותיתרונותמגבלותמתאים ביותר עבור
בדיקת BCA5-2000 מק"ג/מ"ל• תואם לדטרגנטים
• שונות נמוכה בין חלבונים
• פיתוח צבע יציב		• מושפע מחומרים מחזרים
• מושפע מסוכני קישור מסוימים		• כימות חלבונים כללי
• דגימות המכילות דטרגנטים
בדיקת ברדפורד1-1500 מק"ג/מ"ל• מהירה (2-5 דקות)
• מעט חומרים מפריעים		• שונות גבוהה בין חלבונים
• לא תואם לדטרגנטים		• מדידות מהירות
• דגימות ללא דטרגנטים
שיטת לאורי1-1500 מק"ג/מ"ל• מבוססת היטב
• רגישות טובה		• הרבה חומרים מפריעים
• שלבים מרובים		• עקביות היסטורית
• דגימות חלבון טהורות
ספיגה באולטרה-סגול (280 נ"מ)20-3000 מק"ג/מ"ל• לא הרסני
• מהיר מאוד
• ללא חומרי עזר		• מושפע מחומצות גרעין
• דורש דגימות טהורות		• תמיסות חלבון טהורות
• בדיקות מהירות בזמן טיהור
פלואורומטרי0.1-500 מק"ג/מ"ל• רגישות הגבוהה ביותר
• טווח דינמי רחב		• חומרי עזר יקרים
• דורש פלואורומטר		• דגימות מאוד מהולות
• נפח דגימה מוגבל

שאלות נפוצות

למה משמש בדיקת BCA?

בדיקות BCA מאפשרות כימות של ריכוז חלבון כולל בדגימות שלכם. תשתמשו בו בכל פעם שאתם צריכים לדעת כמה חלבון יש לכם - לפני בלוט וסטרן כדי להבטיח טעינה שווה, לפני בדיקות אנזים לנירמול מדדי פעילות, במהלך טיהור חלבון כדי לעקוב אחר תפוקה, או בעת הכנת דגימות לספקטרומטריית מסה. הוא הפך לשיטת ברירת המחדל לכימות חלבון במרבית מעבדות הביולוגיה המולקולרית והביוכימיה מכיוון שהוא מטפל בחומרי ניקוי ורכיבי בופר הנוכחים בתרחיפי תאים טיפוסיים.

כמה מדויקת בדיקת BCA?

בתנאים טובים, צפו לדיוק של 5-10%. זה תלוי בביצוע עקומת סטנדרט נכונה (לפחות 5-6 נקודות המכסות את טווח הריכוז הצפוי), שימוש בריאגנטים טריים, והבטחה שהדגימות שלכם אינן מכילות חומרים מפריעים בריכוזים גבוהים. הרכב החלבון חשוב - קולגן וג'לטין נותנים קריאות גבוהות באופן חריג בשל הרכב החומצות האמיניות שלהם, בעוד היסטונים נותנים קריאות נמוכות יותר. עבור רוב היישומים, שגיאה של 5-10% היא מקובלת והרבה יותר טובה מאשר טעינת דגימות ללא כל כימות.

מה יכול להפריע לתוצאות בדיקת BCA?

חומרים מחזרים הם הבעיה העיקרית - DTT, β-מרקפטואתנול, וגלוטתיון מפחיתים Cu²⁺ ל-Cu¹⁺ באופן בלתי תלוי בחלבון, מנפחים את הקריאות באופן מלאכותי. אם בופר הפירוק שלכם מכיל חומרים מחזרים, דללו את הדגימות לפחות פי 10 כדי למזער הפרעה. חומרים מקבעים (EDTA, EGTA) פועלים בכיוון ההפוך על ידי קשירת יוני נחושת, מפחיתים פיתוח צבע. ריכוזים גבוהים של סוכרים פשוטים, ליפידים, ותרכובות אמוניה יכולים גם להפריע. המדריך הטכני של Thermo Fisher לבדיקת חלבון BCA כולל טבלת תאימות מקיפה.

מה ההבדל בין בדיקות BCA ו-Bradford?

מהירות מול תאימות. Bradford נותן תוצאות תוך 5 דקות, BCA דורש 30 דקות של דגירה. אבל Bradford מתפרק בנוכחות חומרי ניקוי - אפילו 0.1% SDS יקלקל את הקריאות. BCA סובל מ-SDS, Triton X-100, NP-40, וחומרי ניקוי אחרים הנפוצים בפירוק תאים. Bradford גם מראה שונות גבוהה בין חלבונים מכיוון שצבע Coomassie נקשר בהעדפה לחומצות אמיניות בסיסיות. BCA עקבי יותר בין סוגי חלבונים שונים. עבור תרחיפי תאים, BCA הוא בדרך כלל הבחירה הטובה יותר. עבור חלבונים מטוהרים בבופרים ללא חומרי ניקוי, המהירות של Bradford הופכת אותו לאטרקטיבי.

(המשך בתגובה הבאה)

מקורות

  1. סמית' פ"ק, קרון ר"א, הרמנסון ג"ט ואחרים. "מדידת חלבון באמצעות חומצה ביצ'ינכונינית." ביוכימיה אנליטית. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7

  2. תרמו סיינטיפיק. "ערכת בדיקת חלבון פירס BCA." הוראות. זמין בכתובת: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf

  3. וולקר ג'מ. "בדיקת חומצה ביצ'ינכונינית (BCA) לכימות חלבון." בתוך: וולקר ג'מ, עורך. מדריך פרוטוקולי חלבון. ספרינגר; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3

  4. אולסון ב'ג', מרקוול ג'. "בדיקות לקביעת ריכוז חלבון." פרוטוקולים נוכחיים בחלבון. 2007;פרק 3:יחידה 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48

  5. נובל ג'א, בייילי מ'ג'. "כימות חלבון." שיטות באנזימולוגיה. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

ייעל את תהליך כימות החלבונים שלך

בדיקות BCA נותנות לך ריכוזי חלבונים, אך אתה עדיין צריך להמיר את המספרים האלה לנפחי פיפטציה לניסויים בפועל. מחשבון זה מבצע המרה זו מיידית, בין אם אתה מכין בלוט וסטרן בודד או מחשב נפחים עבור 96 דגימות בבת אחת. הזן את קריאות הבליעה, ציין את כמויות החלבון המטרה, וקבל נפחים מדויקים לתוצאות ניסוי עקביות.