Kalkulator topljivosti proteina - Besplatni alat za pH i temperaturu

Kalkulator topljivosti proteina procjenjuje najveću koncentraciju proteina koja ostaje otopljena u otapalu pri zadanom pH, temperaturi i ionskoj jakosti. Osnovnu kemiju pretvara u jedan broj, izražen u miligramima proteina po mililitru otapala.

Topljivost proteina važna je u biokemiji, formulaciji lijekova i znanosti o hrani. Protein koji ne ostaje otopljen stvara agregate ili talog, što može pokvariti eksperiment ili onemogućiti injiciranje lijeka.

Kako izračunati topljivost proteina

Topljivost ovisi o pet čimbenika: izoelektričnoj točki proteina (pH pri kojem je njegov ukupni naboj jednak nuli), njegovu talištu (temperaturi pri kojoj počinje gubiti svoju savijenu strukturu), dielektričnoj konstanti otapala (mjeri koliko dobro razdvaja nabijene čestice), pH-vrijednosti otopine i ionskoj jakosti (mjeri količine otopljene soli).

Kalkulator polazi od poznate topljivosti svakog proteina u vodi pri referentnim uvjetima: 25 °C, pH 7,0 i ionskoj jakosti 0,15 M (otprilike razini soli u krvi). Zatim tu referentnu vrijednost množi s četiri omjera, po jednim za svaki promijenjeni uvjet.

Formula topljivosti proteina

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ označava poznatu topljivost proteina u vodi pri referentnim uvjetima, u mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, pri čemu je $pI$ izoelektrična točka proteina. Topljivost je najmanja u izoelektričnoj točki i raste kako se pH udaljava od nje, a izravnava se unutar nekoliko pH-jedinica.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, pri čemu je $I$ ionska jakost u molima po litri. Pri niskim razinama soli ovaj član blago povećava topljivost (učinak povećanja topljivosti zbog soli). Pri visokim razinama soli smanjuje je (učinak smanjenja topljivosti zbog soli).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, pri čemu je $T_m$ talište proteina u °C. Topljivost blago raste s temperaturom, a zatim naglo pada kada se temperatura približi vrijednosti $T_m$ i protein počne gubiti svoju savijenu strukturu.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, pri čemu je $\varepsilon$ dielektrična konstanta otapala. Voda ima dielektričnu konstantu 78,4, pa je taj član u vodi jednak 1. Otapala koja manje učinkovito razdvajaju naboje od vode, poput etanola, smanjuju topljivost.

Referentne vrijednosti koje koristi kalkulator

Kategorije topljivosti

Primjer: albumin u fosfatnom puferu

Odredite topljivost albumina u fosfatnom puferu pri 25 °C, pH 7,4 i ionskoj jakosti 0,15 M.

Referentne vrijednosti albumina su $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL i $T_m = 63°C$. Fosfatni pufer ima dielektričnu konstantu 76,0.

1. Član za pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Omjer: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Ionski član: ionska jakost (0,15 M) jednaka je referentnoj vrijednosti, pa je omjer 1.
3. Temperaturni član: temperatura (25 °C) jednaka je referentnoj vrijednosti, pa je omjer 1.
4. Član za otapalo: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Kalkulator daje rezultat 492,12 mg/mL, što pripada kategoriji „vrlo topljivo”.

Primjer: lizozim u glicerolu pri niskoj temperaturi

Odredite topljivost lizozima u otopini glicerola pri 4 °C, pH 5,0 i ionskoj jakosti 0,1 M. To su uvjeti slični hladnom skladištenju enzima.

Referentne vrijednosti lizozima su $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL i $T_m = 72°C$. Glicerol ima dielektričnu konstantu 42,5.

1. Član za pH: pomak s pH-vrijednosti 7,0 na pH 5,0 (obje su znatno niže od pI-ja 11,35) samo neznatno mijenja član za pH. Omjer: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Ionski član: smanjenje ionske jakosti s 0,15 M na 0,1 M blago povećava topljivost zbog povećanja topljivosti djelovanjem soli. Omjer: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Temperaturni član: hlađenje s 25 °C na 4 °C, znatno ispod tališta, smanjuje taj član. Omjer: 0,8106.
4. Član za otapalo: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Kalkulator daje rezultat 35,88 mg/mL, što pripada kategoriji „topljivo”. Niska dielektrična konstanta glicerola, a ne niska temperatura, smanjuje rezultat u odnosu na referentnu vrijednost.

Kako upotrebljavati kalkulator topljivosti proteina

1. Odaberite protein s popisa: albumin, inzulin, lizozim, hemoglobin, mioglobin, kolagen, kazein ili fibrinogen.
2. Odaberite otapalo: voda, fosfatni pufer, Tris-pufer, glicerol, DMSO, metanol, etanol ili aceton.
3. Unesite temperaturu u °C (0 do 100), pH (0 do 14) i ionsku jakost u molarima (0 do 2).
4. Očitajte izračunatu topljivost u mg/mL i njezinu kategoriju. Traka ispod rezultata prikazuje vrijednost na ljestvici od 0 do 100 mg/mL i potpuno se ispunjava pri 100 mg/mL ili više.

Što utječe na topljivost proteina

pH i izoelektrična točka. Svaki protein ima izoelektričnu točku, pH pri kojem njegova površina nema ukupni električni naboj. Pri tom pH molekule proteina se međusobno ne odbijaju, pa se lakše skupljaju i izdvajaju iz otopine. Udaljavanje pH-vrijednosti od izoelektrične točke u bilo kojem smjeru daje proteinu ukupni naboj. Nabijene se molekule međusobno odbijaju, što ih drži razdvojenima i otopljenima.

Ionska jakost. Otopljeni ioni soli okružuju nabijene površinske skupine proteina. Pri niskim do umjerenim koncentracijama ti ioni zaklanjaju naboje koji bi inače privlačili dvije molekule proteina, čime se povećava topljivost. To se naziva povećanjem topljivosti pod utjecajem soli. Pri visokim koncentracijama soli ioni se natječu s proteinom za molekule vode i uklanjaju sloj vode koji protein drži otopljenim. To se naziva smanjenjem topljivosti pod utjecajem soli i osnova je čestog postupka pročišćavanja pri kojem se amonijevim sulfatom proteini talože iz smjese.

Temperatura. Zagrijavanje otopine općenito povećava topljivost, do određene granice. Kada se temperatura približi talištu proteina, protein počinje gubiti svoju savijenu strukturu. Odmotavanje izlaže hidrofobne (vodoodbojne) dijelove proteina koji su obično skriveni unutar njegove savijene strukture. Ti se izloženi dijelovi međusobno lijepe i uzrokuju agregaciju, pa topljivost naglo pada blizu tališta i iznad njega.

Otapalo. Dielektrična konstanta otapala mjeri koliko učinkovito ono slabi električnu privlačnost između nabijenih čestica. Voda ima visoku dielektričnu konstantu i dobro razdvaja naboje, zbog čega se većina proteina bolje otapa u vodi nego u organskim otapalima poput etanola ili acetona. Otapala s niskom dielektričnom konstantom omogućuju da se suprotni naboji na različitim molekulama proteina jače privlače, što potiče agregaciju.

Ograničenja

Kalkulator upotrebljava pojednostavljeni model utemeljen na malom skupu referentnih proteina i standardnih otapala. Ne uzima u obzir čistoću proteina, dodatke poput deterdženata ili stabilizatora ni neuobičajene sastojke pufera. Rezultati su procjene za planiranje eksperimenata, a ne zamjena za izravno mjerenje topljivosti u laboratoriju.

Često postavljana pitanja

Što je topljivost proteina? Topljivost proteina najveća je koncentracija proteina koja ostaje potpuno otopljena u otapalu bez stvaranja vidljivih agregata ili taloga.

Zašto je protein najmanje topljiv u izoelektričnoj točki? U izoelektričnoj točki protein nema ukupni električni naboj, pa se molekule proteina više međusobno električki ne odbijaju. Bez tog odbijanja vjerojatnije je da će se slijepiti i izdvojiti iz otopine.

Koja je razlika između povećanja i smanjenja topljivosti pod utjecajem soli? Do povećanja topljivosti pod utjecajem soli dolazi pri niskim koncentracijama soli, kada otopljeni ioni zaklanjaju nabijene skupine proteina jedne od drugih i povećavaju topljivost. Do smanjenja topljivosti pod utjecajem soli dolazi pri visokim koncentracijama soli, kada ioni uklanjaju vodu s površine proteina i smanjuju topljivost.

Povećava li viša temperatura uvijek topljivost? Ne. Topljivost obično raste s temperaturom samo do određene granice. Kada se temperatura približi talištu proteina, protein se počinje odmotavati, što obično uzrokuje agregaciju i nagli pad topljivosti.

Zašto se proteini manje otapaju u etanolu ili acetonu nego u vodi? Voda ima visoku dielektričnu konstantu, što znači da vrlo učinkovito slabi električnu privlačnost između nabijenih dijelova molekula proteina. Etanol i aceton imaju niže dielektrične konstante, pa se nabijene skupine na različitim molekulama proteina u tim otapalima jače privlače, zbog čega je agregacija vjerojatnija.

Koliko je ovaj kalkulator točan? Daje procjenu na temelju fizikalnog modela i malog skupa referentnih proteina i otapala. Koristan je za sužavanje raspona uvjeta koje treba ispitati, ali eksperimentalno mjerenje ostaje jedini način potvrde topljivosti za određeni uzorak proteina.

Dodatna literatura

• Arakawa, T., i Timasheff, S. N. (1984). Mehanizam povećanja i smanjenja topljivosti proteina djelovanjem soli dvovalentnih kationa. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., i Pace, C. N. (2008). Mjerenje i povećavanje topljivosti proteina. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., i Edsall, J. T. (1943). Proteini, aminokiseline i peptidi kao ioni i dipolarni ioni. Reinhold Publishing.