Kalkulator serijskog razrjeđivanja - Laboratorijski alat za koncentraciju

Kalkulator serijskog razrjeđivanja određuje koncentraciju tvari u svakom koraku serije razrjeđivanja. Serijsko razrjeđivanje laboratorijska je tehnika kojom se koncentracija otopine smanjuje u nizu jednakih koraka, pri čemu svaki novi korak razrjeđuje prethodni istim faktorom.

Što je serijsko razrjeđivanje?

Serijsko razrjeđivanje rješava čest laboratorijski problem: uzorak je previše koncentriran da bi se mogao izravno mjeriti ili upotrijebiti. Umjesto mjerenja vrlo malog volumena podložnog pogreškama u jednom koraku, znanstvenik uzorak razrjeđuje nekoliko puta zaredom, upotrebljavajući mali volumen kojim se lako rukuje u svakom koraku.

Svako razrjeđivanje počinje rezultatom prethodnog koraka, a ne izvornim uzorkom. Tako nastaje niz koncentracija koje se svaki put smanjuju za isti faktor. Tehnika se upotrebljava za brojanje bakterija, ispitivanje djelovanja lijeka na stanice pri različitim dozama, izradu kalibracijskih krivulja za laboratorijske analize i pripremu uzoraka DNA za PCR.

Formula serijskog razrjeđivanja

Svaki korak razrjeđivanja slijedi ovu formulu:

$C_2 = \frac{C_1}{DF}$

• C₁ je koncentracija prije koraka
• DF je faktor razrjeđivanja
• C₂ je koncentracija nakon koraka

Za određivanje koncentracije nakon nekoliko koraka odjednom upotrijebite:

$C_n = \frac{C_0}{DF^n}$

• C₀ je početna koncentracija
• DF je faktor razrjeđivanja
• n je broj koraka
• C_n je koncentracija nakon n koraka

Faktor razrjeđivanja mora biti veći od 1. Faktor 1 značio bi da uopće nema razrjeđivanja. Početna koncentracija mora biti veća od 0.

Ovaj kalkulator prihvaća od 1 do 20 koraka i uz njih navodi korak 0, odnosno nerazrijeđeni uzorak. Jedinica koncentracije obična je tekstualna oznaka, primjerice mg/mL ili CFU/mL, a svaki se redak prikazuje u istoj jedinici. Koncentracije se prikazuju na šest značajnih znamenki, a vrijednosti manje od 0,000001 prelaze u znanstveni zapis kako se mali rezultat nikad ne bi prikazao kao nula.

Faktor razrjeđivanja u odnosu na omjer razrjeđivanja

Faktor razrjeđivanja 10 često se zapisuje kao omjer 1:10. Omjer opisuje udjele, a ne sam faktor: 1 udio uzorka i 9 udjela razrjeđivača daju ukupno 10 udjela. Faktor pokazuje koliko je puta nova otopina manje koncentrirana, pa omjer 1:10 odgovara faktoru razrjeđivanja 10, a ne 11.

Uobičajeni faktori razrjeđivanja uključuju:

• 10 (1:10): standardni izbor u mikrobiologiji jer u malom broju koraka obuhvaća širok raspon koncentracija.
• 2 (1:2): uobičajen u farmakologiji, gdje su za izradu krivulje ovisnosti odgovora o dozi potrebni finiji koraci.
• 5 (1:5): srednja mogućnost koja daje više podatkovnih točaka nego 1:10, ali zahtijeva manje koraka nego 1:2.

Primjer: razrjeđivanje bakterijske kulture

Tekuća kultura sadržava procijenjenih 10⁸ jedinica koje tvore kolonije (CFU) po mililitru, što je prevelika gustoća za izravno brojanje. Za brojanje je potrebno između 30 i 300 kolonija po pločici, pa uzorak treba seriju 1:10 sa 6 koraka.

Nasađivanje 100 μL (0,1 mL) iz koraka 5 stavlja na pločicu približno 10² = 100 CFU-a, što je unutar raspona pogodnog za brojanje.

Primjer: serija dvostrukog razrjeđivanja lijeka

Očekuje se da lijek ima IC50 (koncentraciju koja prepolovljuje aktivnost) blizu 25 mg/mL. Ispitivanje raspona oko te vrijednosti zahtijeva seriju 1:2 koja počinje pri 100 mg/mL i ima 5 koraka.

Ova serija obuhvaća očekivani IC50 i daje dovoljno točaka za izradu krivulje ovisnosti odgovora o dozi.

Kako provesti serijsko razrjeđivanje

1. Prije početka označite svaku epruvetu brojem koraka i faktorom razrjeđivanja.
2. Dodajte razrjeđivač u svaku epruvetu osim one s izvornim uzorkom. Za seriju 1:10 dodajte 9 volumena razrjeđivača na 1 volumen u koji će se dodati uzorak.
3. Prenesite izmjereni volumen izvornog uzorka u prvu epruvetu i temeljito promiješajte, bilo vorteksiranjem bilo višekratnim uvlačenjem i izbacivanjem pipetom.
4. Novim nastavkom prenesite isti volumen iz prve epruvete u drugu epruvetu i ponovno promiješajte.
5. Ponovite prijenos i miješanje za svaku preostalu epruvetu.
6. Razrijeđene uzorke upotrijebite bez odgađanja jer žive stanice nastavljaju rasti, a neki se spojevi s vremenom razgrađuju.

Primjene serijskog razrjeđivanja

Mikrobiologija upotrebljava serijsko razrjeđivanje za brojanje bakterijskih kolonija na pločicama i određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC), pri čemu se utvrđuje najniža doza antibiotika koja zaustavlja rast bakterija. Biokemija ga upotrebljava za izradu standardnih krivulja za ispitivanje proteina i pripremu DNA predložaka za PCR pri upotrebljivoj koncentraciji. Farmakologija upotrebljava serije razrjeđivanja za ispitivanje lijekova u rasponu doza i izračun vrijednosti kao što je IC50. Imunologija ga upotrebljava za kalibracijske krivulje ELISA-e i titraciju protutijela, kojom se utvrđuje najveće razrjeđenje koje još daje pozitivan rezultat.

Uobičajene pogreške

Loše miješanje svake epruvete čest je izvor pogrešaka jer se čestice i stanice mogu taložiti umjesto da ostanu ravnomjerno raspoređene. Ponovna uporaba nastavka pipete može prenijeti dovoljno materijala iz koncentriranije epruvete da poremeti kasnija očitanja. Zamjena omjera razrjeđivanja s faktorom razrjeđivanja dovodi do pogrešnih volumena: razrjeđivanje 1:10 znači 1 udio uzorka i 9 udjela razrjeđivača, a ne 1 udio i 10. Zaokruživanje koncentracije u svakom koraku, umjesto izravnog izračuna konačne vrijednosti iz C₀/DF^n, može tijekom nekoliko koraka dovesti do primjetne pogreške.

Povijest

Robert Koch razvio je kvantitativne metode za brojanje bakterijskih kolonija u 1880-im godinama, proučavajući tuberkulozu i koleru, čime je postavio temelje metode brojanja na pločicama koja se i danas upotrebljava. Zračna mikropipeta s istiskivanjem zraka, koju je Heinrich Schnitger izumio 1957, kasnije je omogućila precizno mjerenje mikrolitarskih volumena, čime su serije finih i ponovljivih razrjeđivanja postale praktične u molekularnoj biologiji i imunoanalizama.

Često postavljana pitanja

Kako se izračunava serijsko razrjeđivanje? Upotrijebite C_n = C₀ / DF^n, pri čemu je C₀ početna koncentracija, DF faktor razrjeđivanja, a n broj koraka. Primjerice, 100 mg/mL razrijeđeno faktorom 10 tijekom 3 koraka daje 100 / 10³ = 0,1 mg/mL.

Koja je razlika između faktora razrjeđivanja i omjera razrjeđivanja? Omjer razrjeđivanja, kao što je 1:10, opisuje udjele: 1 udio uzorka pomiješan s 9 udjela razrjeđivača daje ukupno 10 udjela. Faktor razrjeđivanja sam je broj 10, što znači da je otopina deset puta manje koncentrirana.

Zašto upotrebljavati nekoliko malih koraka razrjeđivanja umjesto jednog velikog? Prijenosi malih i jednakih volumena lakše se precizno pipetiraju nego jedno vrlo veliko razrjeđivanje. Serija od šest koraka 1:10 također doseže milijunsko razrjeđivanje, raspon koji je teško precizno postići u jednom koraku.

Koliko je serijsko razrjeđivanje precizno? Uz kalibrirane pipete i pažljivu tehniku serija je obično točna unutar 5 do 10 posto, što odgovara većini mikrobioloških postupaka. Primjene koje zahtijevaju veću preciznost, poput farmaceutskih standarda, često umjesto toga upotrebljavaju paralelna razrjeđivanja izrađena izravno iz matične otopine.

Koji je najveći koristan broj koraka razrjeđivanja? Ovaj kalkulator omogućuje do 20 koraka. Većina laboratorijskih protokola upotrebljava 6 do 10 koraka jer se pogreška povećava svakim dodatnim prijenosom. Veći faktor razrjeđivanja smanjuje potreban broj koraka; primjerice, tri koraka s 1:100 dosežu isto razrjeđivanje 10⁻⁶ kao šest koraka s 1:10.

Može li se faktor razrjeđivanja mijenjati između koraka u istoj seriji? Da, ali većina protokola zadržava stalan faktor jer je fiksni faktor jednostavnije izračunati, pipetirati i ponoviti. Serija s promjenjivim faktorom povremeno se upotrebljava kada je za jedan dio raspona koncentracija potrebna veća razlučivost nego za drugi.