Hitung volume sampel yang tepat berdasarkan pembacaan absorbansi uji BCA dan massa protein yang diinginkan. Penting untuk pemuatan protein yang konsisten dalam western blot dan aplikasi laboratorium lainnya.
Alat ini menghitung volume sampel yang diperlukan berdasarkan hasil absorbansi BCA dan massa sampel. Masukkan nilai absorbansi dan massa sampel untuk setiap sampel untuk menghitung volume sampel yang sesuai.
Volume sampel dihitung menggunakan rumus berikut:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Kalkulator Volume Sampel Absorbansi BCA adalah alat khusus yang dirancang untuk membantu peneliti dan teknisi laboratorium menentukan volume sampel yang tepat untuk eksperimen berdasarkan hasil uji BCA (asam bicinchoninic). Kalkulator ini mengambil pembacaan absorbansi dari uji BCA Anda dan massa sampel yang diinginkan untuk menghitung volume yang tepat yang dibutuhkan untuk pemuatan protein yang konsisten dalam aplikasi seperti western blotting, uji enzimatik, dan teknik analisis protein lainnya.
Uji BCA adalah salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk kuantifikasi protein di laboratorium biokimia dan biologi molekuler. Dengan mengukur absorbansi sampel protein Anda dan membandingkannya dengan kurva standar, Anda dapat menentukan konsentrasi protein dengan akurasi tinggi. Kalkulator kami menyederhanakan proses ini dengan secara otomatis mengonversi pembacaan absorbansi menjadi volume sampel yang tepat yang diperlukan untuk eksperimen Anda.
Uji Asam Bicinchoninic (BCA) adalah uji biokimia untuk menentukan konsentrasi total protein dalam larutan. Prinsip dari uji ini bergantung pada pembentukan kompleks Cu²⁺-protein dalam kondisi alkali, diikuti dengan reduksi Cu²⁺ menjadi Cu¹⁺. Jumlah reduksi sebanding dengan protein yang ada. BCA membentuk kompleks berwarna ungu dengan Cu¹⁺ dalam lingkungan alkali, memberikan dasar untuk memantau reduksi tembaga oleh protein.
Intensitas warna ungu meningkat sebanding dengan konsentrasi protein, yang dapat diukur menggunakan spektrofotometer pada sekitar 562 nm. Pembacaan absorbansi kemudian dibandingkan dengan kurva standar untuk menentukan konsentrasi protein dalam sampel yang tidak diketahui.
Rumus dasar untuk menghitung volume sampel dari hasil absorbansi BCA adalah:
Di mana:
Konsentrasi protein dihitung dari pembacaan absorbansi menggunakan persamaan kurva standar:
Untuk uji BCA standar, kemiringan tipikal adalah sekitar 2.0, dan intercept sering kali mendekati nol, meskipun nilai-nilai ini dapat bervariasi berdasarkan kondisi uji spesifik Anda dan kurva standar.
Kalkulator kami menyederhanakan proses penentuan volume sampel dari hasil uji BCA. Ikuti langkah-langkah ini untuk mendapatkan perhitungan yang akurat:
Masukkan Informasi Sampel:
Pilih Jenis Kurva Standar:
Lihat Hasil:
Salin atau Ekspor Hasil:
Mari kita melalui contoh praktis:
Ini berarti Anda harus memuat 13.33 μL dari sampel Anda untuk mendapatkan 20 μg protein.
Kalkulator memberikan beberapa informasi penting:
Konsentrasi Protein: Ini dihitung dari pembacaan absorbansi menggunakan kurva standar yang dipilih. Ini mewakili jumlah protein per unit volume dalam sampel Anda (μg/μL).
Volume Sampel: Ini adalah volume sampel Anda yang mengandung jumlah protein yang diinginkan. Nilai ini adalah yang akan Anda gunakan saat menyiapkan eksperimen Anda.
Peringatan dan Rekomendasi: Kalkulator mungkin memberikan peringatan untuk:
Salah satu aplikasi paling umum untuk kalkulator ini adalah menyiapkan sampel untuk western blotting. Pemuatan protein yang konsisten sangat penting untuk hasil western blot yang dapat diandalkan, dan kalkulator ini memastikan Anda memuat jumlah protein yang sama untuk setiap sampel, bahkan ketika konsentrasi mereka berbeda.
Alur kerja contoh:
Untuk uji enzimatik, sering kali perlu menggunakan jumlah protein tertentu untuk menstandarisasi kondisi reaksi di seluruh sampel atau eksperimen yang berbeda.
Alur kerja contoh:
Dalam eksperimen imunopresipitasi (IP), memulai dengan jumlah protein yang konsisten penting untuk membandingkan hasil di seluruh kondisi yang berbeda.
Alur kerja contoh:
Selama pemurnian protein, sering kali perlu melacak konsentrasi protein dan menghitung hasil pada langkah-langkah yang berbeda.
Alur kerja contoh:
Sementara kalkulator menyediakan parameter default untuk uji BCA standar, Anda juga dapat memasukkan nilai kustom jika Anda telah menghasilkan kurva standar Anda sendiri. Ini sangat berguna ketika:
Untuk menggunakan kurva standar kustom:
Kalkulator memungkinkan Anda menambahkan beberapa sampel dan menghitung volume mereka secara bersamaan. Ini sangat berguna saat menyiapkan sampel untuk eksperimen yang memerlukan pemuatan protein yang konsisten di seluruh kondisi yang berbeda.
Manfaat pemrosesan batch:
Jika pembacaan absorbansi Anda di atas 2.0, itu mungkin berada di luar rentang linier uji BCA. Dalam kasus seperti itu:
Untuk pembacaan absorbansi di bawah 0.1, Anda mungkin mendekati batas deteksi uji, yang dapat mempengaruhi akurasi. Pertimbangkan:
Jika kalkulator menunjukkan volume yang terlalu besar untuk aplikasi Anda:
Kuantifikasi protein yang akurat telah menjadi kebutuhan dasar dalam biokimia dan biologi molekuler sejak munculnya bidang ini. Metode awal bergantung pada penentuan kandungan nitrogen, yang memakan waktu dan memerlukan peralatan khusus.
Metode Kjeldahl (1883): Salah satu metode paling awal untuk kuantifikasi protein, berdasarkan pengukuran kandungan nitrogen.
Uji Biuret (Awal 1900-an): Metode ini bergantung pada reaksi antara ikatan peptida dan ion tembaga dalam larutan alkali, menghasilkan warna ungu.
Uji Lowry (1951): Dikembangkan oleh Oliver Lowry, metode ini menggabungkan reaksi Biuret dengan reagen Folin-Ciocalteu, meningkatkan sensitivitas.
Uji Bradford (1976): Marion Bradford mengembangkan metode ini menggunakan pewarna Coomassie Brilliant Blue G-250, yang mengikat protein dan menggeser maksimum penyerapan.
Uji BCA (1985): Dikembangkan oleh Paul Smith dan rekan-rekannya di Pierce Chemical Company, metode ini menggabungkan reaksi biuret dengan deteksi BCA, menawarkan sensitivitas yang lebih baik dan kompatibilitas dengan deterjen.
Uji BCA pertama kali dijelaskan dalam makalah tahun 1985 oleh Smith et al. berjudul "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Metode ini dikembangkan untuk mengatasi keterbatasan metode yang ada, terutama gangguan dari berbagai bahan kimia yang umum digunakan dalam ekstraksi dan pemurnian protein.
Inovasi kunci adalah menggunakan asam bicinchoninic untuk mendeteksi ion Cu¹⁺ yang dihasilkan oleh reduksi Cu²⁺ yang dimediasi protein, membentuk kompleks berwarna ungu yang dapat diukur secara spektrofotometrik. Ini memberikan beberapa keuntungan:
Sejak diperkenalkan, uji BCA telah menjadi salah satu metode kuantifikasi protein yang paling banyak digunakan di laboratorium biokimia dan biologi molekuler di seluruh dunia.
1=IF(B2<=0,"Error: Absorbansi tidak valid",IF(C2<=0,"Error: Massa sampel tidak valid",C2/(2*B2)))
2
3' Di mana:
4' B2 berisi pembacaan absorbansi
5' C2 berisi massa sampel yang diinginkan dalam μg
6' Rumus ini mengembalikan volume sampel yang dibutuhkan dalam μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Menghitung konsentrasi protein dari absorbansi menggunakan kurva standar."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbansi tidak dapat negatif")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Menghitung volume sampel yang dibutuhkan berdasarkan absorbansi dan massa yang diinginkan."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Massa sampel harus positif")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Konsentrasi protein yang dihitung harus positif")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Contoh penggunaan
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Untuk absorbansi {absorbance} dan massa protein yang diinginkan {sample_mass} μg:")
31 print(f"Konsentrasi protein: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Volume sampel yang dibutuhkan: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Error: {e}")
351# Fungsi untuk menghitung konsentrasi protein dari absorbansi
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbansi tidak dapat negatif")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Fungsi untuk menghitung volume sampel
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Massa sampel harus positif")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Konsentrasi protein yang dihitung harus positif")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Contoh penggunaan
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Untuk absorbansi %.2f dan massa protein yang diinginkan %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Konsentrasi protein: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Volume sampel yang dibutuhkan: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Error: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbansi tidak dapat negatif");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Massa sampel harus positif");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Konsentrasi protein yang dihitung harus positif");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Contoh penggunaan
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Untuk absorbansi ${absorbance} dan massa protein yang diinginkan ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Konsentrasi protein: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Volume sampel yang dibutuhkan: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Error: ${error.message}`);
37}
38Hubungan antara absorbansi dan konsentrasi protein biasanya linier dalam rentang tertentu. Di bawah ini adalah visualisasi kurva standar BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Berbagai metode kuantifikasi protein memiliki keuntungan dan keterbatasan yang berbeda. Berikut adalah bagaimana uji BCA dibandingkan dengan metode umum lainnya:
| Metode | Rentang Sensitivitas | Keuntungan | Keterbatasan | Terbaik Untuk |
|---|---|---|---|---|
| Uji BCA | 5-2000 μg/mL | • Kompatibel dengan deterjen • Variasi protein-ke-protein yang lebih sedikit • Stabilitas pengembangan warna | • Terpengaruh oleh agen reduksi • Dipengaruhi oleh beberapa agen pengikat | • Kuantifikasi protein umum • Sampel yang mengandung deterjen |
| Uji Bradford | 1-1500 μg/mL | • Cepat (2-5 menit) • Sedikit zat pengganggu | • Variasi protein-ke-protein yang tinggi • Tidak kompatibel dengan deterjen | • Pengukuran cepat • Sampel bebas deterjen |
| Metode Lowry | 1-1500 μg/mL | • Teruji dengan baik • Sensitivitas yang baik | • Banyak zat yang mengganggu • Beberapa langkah | • Konsistensi historis • Sampel protein murni |
| Absorbansi UV (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Tidak merusak • Sangat cepat • Tidak perlu reagen | • Terpengaruh oleh asam nukleat • Memerlukan sampel murni | • Larutan protein murni • Pemeriksaan cepat selama pemurnian |
| Fluorometrik | 0.1-500 μg/mL | • Sensitivitas tertinggi • Rentang dinamis yang luas | • Reagen mahal • Memerlukan fluorometer | • Sampel yang sangat encer • Volume sampel terbatas |
Uji BCA (asam bicinchoninic) terutama digunakan untuk mengkuantifikasi konsentrasi total protein dalam sampel. Ini banyak digunakan dalam biokimia, biologi sel, dan biologi molekuler untuk aplikasi seperti western blotting, uji enzimatik, imunopresipitasi, dan pemurnian protein.
Uji BCA umumnya akurat dalam kisaran 5-10% ketika dilakukan dengan benar. Akurasinya tergantung pada beberapa faktor termasuk kualitas kurva standar, tidak adanya zat yang mengganggu, dan apakah komposisi protein yang tidak diketahui mirip dengan protein standar yang digunakan.
Beberapa zat dapat mengganggu hasil uji BCA, termasuk:
Perbedaan utama adalah:
Jika kalkulator Anda menunjukkan volume yang sangat besar, biasanya menunjukkan konsentrasi protein yang rendah dalam sampel Anda. Ini bisa disebabkan oleh:
Pertimbangkan untuk mengkonsentrasikan sampel Anda atau menyesuaikan desain eksperimen Anda untuk mengakomodasi konsentrasi protein yang lebih rendah.
Kalkulator ini dirancang khusus untuk hasil uji BCA. Meskipun prinsip dasar (mengonversi konsentrasi menjadi volume) berlaku untuk metode lain, hubungan antara absorbansi dan konsentrasi protein bervariasi antara uji yang berbeda. Untuk metode lain seperti Bradford atau Lowry, Anda perlu menggunakan parameter kurva standar yang berbeda.
Untuk pembacaan absorbansi di luar rentang linier (biasanya >2.0):
Albumin Serum Sapi (BSA) adalah standar yang paling umum digunakan untuk uji BCA karena:
Namun, jika sampel Anda mengandung protein dominan yang berbeda secara signifikan dari BSA, pertimbangkan untuk menggunakan protein tersebut sebagai standar Anda untuk hasil yang lebih akurat.
Warna ungu yang berkembang dalam reaksi BCA stabil selama beberapa jam pada suhu kamar dan dapat diukur kapan saja dalam periode tersebut. Namun, untuk hasil terbaik, disarankan untuk mengukur semua standar dan sampel pada waktu yang hampir sama setelah pengembangan warna.
Meskipun secara teknis mungkin untuk menggunakan kembali kurva standar, tidak disarankan untuk kuantifikasi yang akurat. Variasi dalam reagen, kondisi inkubasi, dan kalibrasi instrumen dapat mempengaruhi hubungan antara absorbansi dan konsentrasi protein. Untuk hasil yang dapat diandalkan, buatlah kurva standar baru setiap kali Anda melakukan uji.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Pengukuran protein menggunakan asam bicinchoninic." Biokimia Analitik. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Kit Uji Protein BCA Pierce." Instruksi. Tersedia di: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "Uji Asam Bicinchoninic (BCA) untuk Kuantifikasi Protein." Dalam: Walker JM, ed. Buku Protokol Protein. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Uji untuk penentuan konsentrasi protein." Protokol Saat Ini dalam Ilmu Protein. 2007;Bab 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Kuantifikasi protein." Metode dalam Enzimologi. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Sekarang Anda memahami prinsip di balik kuantifikasi protein BCA dan perhitungan volume sampel, coba kalkulator kami untuk menyederhanakan alur kerja laboratorium Anda. Cukup masukkan pembacaan absorbansi Anda dan massa sampel yang diinginkan untuk mendapatkan perhitungan volume sampel yang instan dan akurat.
Baik Anda sedang menyiapkan sampel untuk western blotting, uji enzimatik, atau eksperimen berbasis protein lainnya, kalkulator kami akan membantu memastikan hasil yang konsisten dan dapat diandalkan. Hemat waktu, kurangi kesalahan, dan tingkatkan reproduktifitas eksperimen Anda dengan Kalkulator Volume Sampel Absorbansi BCA.
Temukan lebih banyak alat yang mungkin berguna untuk alur kerja Anda