Calcola volumi di campione precisi basati sulle letture di assorbanza del saggio BCA e sulla massa proteica desiderata. Essenziale per un caricamento proteico coerente nei western blot e in altre applicazioni di laboratorio.
Questo strumento calcola il volume del campione richiesto in base ai risultati di assorbimento BCA e alla massa del campione. Inserisci il valore di assorbimento e la massa del campione per ciascun campione per calcolare il volume del campione corrispondente.
Il volume del campione è calcolato utilizzando la seguente formula:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Il Calcolatore del Volume del Campione di Assorbanza BCA è uno strumento specializzato progettato per aiutare i ricercatori e i tecnici di laboratorio a determinare con precisione il volume del campione appropriato per esperimenti basati sui risultati dell'assay BCA (acido bicinchonico). Questo calcolatore prende le letture di assorbanza dal tuo assay BCA e la massa del campione desiderata per calcolare il volume preciso necessario per un caricamento di proteine coerente in applicazioni come il western blotting, gli assay enzimatici e altre tecniche di analisi delle proteine.
L'assay BCA è uno dei metodi più ampiamente utilizzati per la quantificazione delle proteine nei laboratori di biochimica e biologia molecolare. Misurando l'assorbanza dei tuoi campioni proteici e confrontandoli con una curva standard, puoi determinare la concentrazione di proteine con alta precisione. Il nostro calcolatore semplifica questo processo convertendo automaticamente le letture di assorbanza nei volumi esatti richiesti per i tuoi esperimenti.
L'assay Bicinchonico (BCA) è un assay biochimico per determinare la concentrazione totale di proteine in una soluzione. Il principio di questo assay si basa sulla formazione di un complesso Cu²⁺-proteina in condizioni alcaline, seguito dalla riduzione di Cu²⁺ a Cu¹⁺. La quantità di riduzione è proporzionale alla proteina presente. Il BCA forma un complesso di colore viola con Cu¹⁺ in ambienti alcalini, fornendo una base per monitorare la riduzione del rame da parte delle proteine.
L'intensità del colore viola aumenta proporzionalmente con la concentrazione di proteine, che può essere misurata utilizzando uno spettrofotometro a circa 562 nm. Le letture di assorbanza vengono quindi confrontate con una curva standard per determinare la concentrazione di proteine nei campioni sconosciuti.
La formula fondamentale per calcolare il volume del campione dai risultati di assorbanza BCA è:
Dove:
La concentrazione di proteine è calcolata dalla lettura di assorbanza utilizzando l'equazione della curva standard:
Per un assay BCA standard, l'inclinazione tipica è di circa 2.0, e l'intercetta è spesso vicina a zero, anche se questi valori possono variare in base alle condizioni specifiche del tuo assay e della curva standard.
Il nostro calcolatore semplifica il processo di determinazione dei volumi dei campioni dai risultati dell'assay BCA. Segui questi passaggi per ottenere calcoli accurati:
Inserisci le Informazioni sul Campione:
Seleziona il Tipo di Curva Standard:
Visualizza i Risultati:
Copia o Esporta i Risultati:
Facciamo un esempio pratico:
Ciò significa che dovresti caricare 13.33 μL del tuo campione per ottenere 20 μg di proteine.
Il calcolatore fornisce diversi pezzi di informazione importanti:
Concentrazione di Proteine: Questa è calcolata dalla tua lettura di assorbanza utilizzando la curva standard selezionata. Rappresenta la quantità di proteine per unità di volume nel tuo campione (μg/μL).
Volume del Campione: Questo è il volume del tuo campione che contiene la quantità desiderata di proteine. Questo valore è ciò che utilizzerai quando prepari i tuoi esperimenti.
Avvertenze e Raccomandazioni: Il calcolatore può fornire avvertenze per:
Una delle applicazioni più comuni per questo calcolatore è la preparazione dei campioni per il western blotting. Un caricamento coerente delle proteine è cruciale per risultati affidabili del western blot, e questo calcolatore assicura che tu carichi la stessa quantità di proteine per ogni campione, anche quando le loro concentrazioni differiscono.
Flusso di lavoro esempio:
Per gli assay enzimatici, è spesso necessario utilizzare una quantità specifica di proteine per standardizzare le condizioni di reazione tra diversi campioni o esperimenti.
Flusso di lavoro esempio:
Negli esperimenti di immunoprecipitazione (IP), iniziare con una quantità coerente di proteine è importante per confrontare i risultati tra diverse condizioni.
Flusso di lavoro esempio:
Durante la purificazione delle proteine, è spesso necessario tenere traccia della concentrazione di proteine e calcolare i rendimenti in diverse fasi.
Flusso di lavoro esempio:
Sebbene il calcolatore fornisca parametri predefiniti per gli assay BCA standard, puoi anche inserire valori personalizzati se hai generato la tua curva standard. Questo è particolarmente utile quando:
Per utilizzare una curva standard personalizzata:
Il calcolatore ti consente di aggiungere più campioni e calcolare i loro volumi simultaneamente. Questo è particolarmente utile quando prepari campioni per esperimenti che richiedono un caricamento coerente delle proteine attraverso più condizioni.
Vantaggi dell'elaborazione in batch:
Se la tua lettura di assorbanza è superiore a 2.0, potrebbe essere al di fuori dell'intervallo lineare dell'assay BCA. In questi casi:
Per letture di assorbanza inferiori a 0.1, potresti essere vicino al limite di rilevamento dell'assay, il che potrebbe influenzare l'accuratezza. Considera:
Se il calcolatore suggerisce un volume che è troppo grande per la tua applicazione:
La quantificazione accurata delle proteine è stata una necessità fondamentale in biochimica e biologia molecolare sin dall'emergere di questi campi. I metodi iniziali si basavano sulla determinazione del contenuto di azoto, che era dispendioso in termini di tempo e richiedeva attrezzature specializzate.
Metodo Kjeldahl (1883): Uno dei primi metodi per la quantificazione delle proteine, basato sulla misurazione del contenuto di azoto.
Test Biuret (Inizio 1900): Questo metodo si basa sulla reazione tra legami peptidici e ioni di rame in una soluzione alcalina, producendo un colore viola.
Assay Lowry (1951): Sviluppato da Oliver Lowry, questo metodo ha combinato la reazione Biuret con il reagente Folin-Ciocalteu, aumentando la sensibilità.
Assay Bradford (1976): Marion Bradford ha sviluppato questo metodo utilizzando il colorante Coomassie Brilliant Blue G-250, che si lega alle proteine e sposta il massimo di assorbimento.
Assay BCA (1985): Sviluppato da Paul Smith e colleghi della Pierce Chemical Company, questo metodo ha combinato la reazione biuret con la rilevazione BCA, offrendo una sensibilità migliorata e compatibilità con i detergenti.
L'assay BCA è stato descritto per la prima volta in un articolo del 1985 di Smith et al. intitolato "Measurement of protein using bicinchoninic acid." È stato sviluppato per affrontare le limitazioni dei metodi esistenti, in particolare l'interferenza da varie sostanze chimiche comunemente utilizzate nell'estrazione e purificazione delle proteine.
L'innovazione chiave è stata l'uso dell'acido bicinchonico per rilevare gli ioni Cu¹⁺ prodotti dalla riduzione mediata dalle proteine di Cu²⁺, formando un complesso di colore viola che poteva essere misurato spettrofotometricamente. Questo ha fornito diversi vantaggi:
Dalla sua introduzione, l'assay BCA è diventato uno dei metodi di quantificazione delle proteine più utilizzati nei laboratori di biochimica e biologia molecolare in tutto il mondo.
1=IF(B2<=0,"Errore: Assorbanza non valida",IF(C2<=0,"Errore: Massa del campione non valida",C2/(2*B2)))
2
3' Dove:
4' B2 contiene la lettura di assorbanza
5' C2 contiene la massa del campione desiderata in μg
6' La formula restituisce il volume del campione richiesto in μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Calcola la concentrazione di proteine dalla assorbanza utilizzando la curva standard."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("L'assorbanza non può essere negativa")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Calcola il volume del campione richiesto in base all'assorbanza e alla massa desiderata."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("La massa del campione deve essere positiva")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("La concentrazione di proteine calcolata deve essere positiva")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Esempio di utilizzo
23assorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(assorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Per assorbanza {assorbance} e massa di proteine desiderata {sample_mass} μg:")
31 print(f"Concentrazione di proteine: {calculate_protein_concentration(assorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Volume del campione richiesto: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Errore: {e}")
351# Funzione per calcolare la concentrazione di proteine dall'assorbanza
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("L'assorbanza non può essere negativa")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funzione per calcolare il volume del campione
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("La massa del campione deve essere positiva")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("La concentrazione di proteine calcolata deve essere positiva")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Esempio di utilizzo
25assorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(assorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(assorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Per assorbanza %.2f e massa di proteine desiderata %.2f μg:\n", assorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Concentrazione di proteine: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Volume del campione richiesto: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Errore: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("L'assorbanza non può essere negativa");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("La massa del campione deve essere positiva");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("La concentrazione di proteine calcolata deve essere positiva");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Esempio di utilizzo
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Per assorbanza ${assorbance} e massa di proteine desiderata ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Concentrazione di proteine: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Volume del campione richiesto: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Errore: ${error.message}`);
37}
38La relazione tra assorbanza e concentrazione di proteine è tipicamente lineare all'interno di un certo intervallo. Di seguito è riportata una visualizzazione di una curva standard BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Diversi metodi di quantificazione delle proteine hanno vari vantaggi e limitazioni. Ecco come l'assay BCA si confronta con altri metodi comuni:
| Metodo | Intervallo di Sensibilità | Vantaggi | Limitazioni | Migliore per |
|---|---|---|---|---|
| Assay BCA | 5-2000 μg/mL | • Compatibile con i detergenti • Minore variazione da proteina a proteina • Stabilità dello sviluppo del colore | • Interferito da agenti riducenti • Influenzato da alcuni agenti chelanti | • Quantificazione generale delle proteine • Campioni contenenti detergenti |
| Assay Bradford | 1-1500 μg/mL | • Rapido (2-5 min) • Poche sostanze interferenti | • Alta variazione da proteina a proteina • Incompatibile con i detergenti | • Misurazioni rapide • Campioni privi di detergenti |
| Metodo Lowry | 1-1500 μg/mL | • Ben consolidato • Buona sensibilità | • Molte sostanze interferenti • Più passaggi | • Coerenza storica • Campioni di proteine pure |
| Assorbanza UV (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Non distruttivo • Molto rapido • Nessun reagente necessario | • Influenzato da acidi nucleici • Richiede campioni puri | • Soluzioni di proteine pure • Controlli rapidi durante la purificazione |
| Fluorometrico | 0.1-500 μg/mL | • Sensibilità massima • Ampio intervallo dinamico | • Reagenti costosi • Richiede fluorometro | • Campioni molto diluiti • Volume di campione limitato |
L'assay BCA (acido bicinchonico) è principalmente utilizzato per quantificare la concentrazione totale di proteine in un campione. È ampiamente utilizzato in biochimica, biologia cellulare e biologia molecolare per applicazioni come il western blotting, gli assay enzimatici, l'immunoprecipitazione e la purificazione delle proteine.
L'assay BCA è generalmente accurato entro il 5-10% quando eseguito correttamente. La sua accuratezza dipende da diversi fattori, tra cui la qualità della curva standard, l'assenza di sostanze interferenti e se la composizione della proteina sconosciuta è simile a quella della proteina standard utilizzata.
Diverse sostanze possono interferire con i risultati dell'assay BCA, tra cui:
Le principali differenze sono:
Se il tuo calcolatore mostra un volume del campione molto grande, di solito indica una bassa concentrazione di proteine nel tuo campione. Questo potrebbe essere dovuto a:
Considera di concentrare il tuo campione o di regolare il tuo design sperimentale per adattarsi alla bassa concentrazione di proteine.
Questo calcolatore è specificamente progettato per i risultati dell'assay BCA. Sebbene il principio di base (convertire la concentrazione in volume) si applichi ad altri metodi, la relazione tra assorbanza e concentrazione di proteine varia tra i diversi assay. Per altri metodi come Bradford o Lowry, dovresti utilizzare parametri di curva standard diversi.
Per letture di assorbanza al di fuori dell'intervallo lineare (tipicamente >2.0):
L'albumina sierica bovina (BSA) è il standard più comunemente utilizzato per gli assay BCA perché è:
Tuttavia, se i tuoi campioni contengono una proteina predominante che differisce significativamente dalla BSA, considera di utilizzare quella proteina come tuo standard per risultati più accurati.
Il colore viola sviluppato nella reazione BCA è stabile per diverse ore a temperatura ambiente e può essere misurato in qualsiasi momento all'interno di quel periodo. Tuttavia, per i migliori risultati, è consigliabile misurare tutti gli standard e i campioni all'incirca nello stesso momento dopo lo sviluppo del colore.
Sebbene sia tecnicamente possibile riutilizzare una curva standard, non è raccomandato per una quantificazione accurata. Variazioni nei reagenti, nelle condizioni di incubazione e nella calibrazione degli strumenti possono influenzare la relazione tra assorbanza e concentrazione di proteine. Per risultati affidabili, genera una nuova curva standard ogni volta che esegui l'assay.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Istruzioni. Disponibile su: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Ora che comprendi i principi dietro la quantificazione delle proteine BCA e il calcolo del volume del campione, prova il nostro calcolatore per semplificare il tuo flusso di lavoro in laboratorio. Basta inserire le tue letture di assorbanza e la massa del campione desiderata per ottenere calcoli di volume del campione istantanei e accurati.
Che tu stia preparando campioni per il western blotting, gli assay enzimatici o qualsiasi altro esperimento basato su proteine, il nostro calcolatore aiuterà a garantire risultati coerenti e affidabili. Risparmia tempo, riduci gli errori e migliora la riproducibilità dei tuoi esperimenti con il Calcolatore del Volume del Campione di Assorbanza BCA.
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