DNS hibridizācijas temperatūras kalkulators | Bezmaksas PĶR Tm rīks

Kas ir DNS atkvēlināšanas temperatūras kalkulators?

DNS atkvēlināšanas temperatūras kalkulators aprēķina DNS praimeru kušanas temperatūru (Tm) pēc tā sekvences. Tm ir temperatūra, kurā puse praimeru molekulu ir saistīta ar mērķa virkni, bet otra puse nav saistīta. Polimerāzes ķēdes reakcijā (PCR) šī vērtība nosaka temperatūru, ko izmanto praimeru piesaistei DNS matricai.

Kāpēc atkvēlināšanas temperatūra ir svarīga PCR

PCR kopē mērķa DNS fragmentu, atkārtoti veicot karsēšanas un dzesēšanas ciklus. Katrā ciklā ir trīs posmi. Vispirms aptuveni pie 95 °C temperatūras karstums atdala divpavedienu matricu. Šo posmu sauc par denaturāciju. Otrajā posmā reakciju atdzesē līdz atkvēlināšanas temperatūrai, parasti no 50 °C līdz 65 °C, lai īsie praimeri varētu piesaistīties atbilstošām sekvencēm uz vienpavedienu DNS. Trešajā posmā temperatūru paaugstina aptuveni līdz 72 °C, un enzīms, ko sauc par DNS polimerāzi, pagarina praimerus, veidojot jaunas DNS virknes.

Ja atkvēlināšanas temperatūra ir pārāk zema, praimeri piesaistās sekvencēm, kas sakrīt tikai daļēji, un veidojas papildu nevēlami DNS fragmenti. Ja temperatūra ir pārāk augsta, praimeri nevar izveidot stabilu saiti ar matricu, tāpēc tiek nokopēts maz DNS vai DNS netiek nokopēts nemaz. Atkvēlināšanas temperatūra ir viens no pirmajiem iestatījumiem, ko pētnieki maina, ja PCR reakcija neizdodas.

Kā GC saturs ietekmē Tm

Praimeris ar mērķi sapārojas, veidojot ūdeņraža saites. Guanīna–citozīna (G-C) pāris veido trīs ūdeņraža saites. Adenīna–timīna (A-T) pāris veido divas. Praimerim, kurā ir vairāk G un C bāzu, nepieciešams vairāk siltuma, lai to atdalītu, tāpēc tā Tm ir augstāka nekā tāda paša garuma praimerim, kurā ir vairāk A un T bāzu. GC saturu parasti izsaka procentos: G un C bāzu skaitu dala ar kopējo sekvences garumu un reizina ar 100.

DNS atkvēlināšanas temperatūras formula

Šis kalkulators izmanto vienu no divām formulām atkarībā no praimeru garuma.

Praimeriem, kuru garums ir 14 nukleotīdi vai lielāks, tas izmanto Marmura–Doti GC satura formulu:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Šeit N_GC ir G un C bāzu skaits praimerā, ko skaita tieši, nevis izsaka procentos. N ir kopējais bāzu skaits.

Praimeriem, kas ir īsāki par 14 nukleotīdiem, tas izmanto Vollesa likumu:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G un C katrs apzīmē attiecīgās bāzes skaitu praimerī.

Abas formulas pieņem parastus PCR apstākļus: aptuveni 50 nanomolāru praimeru un 50 milimolāru Na+.

Aprēķina piemērs

Ņemsim praimeri, kas sastāv no 19 bāzēm ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Tā garums ir 19, kas ir 14 vai vairāk, tāpēc kalkulators izmanto Marmura–Doti formulu.

• Garums (N) = 19
• G skaits = 5, C skaits = 5, tātad N_GC = 10, un GC saturs ir 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Formula izmanto GC skaitu, 10, nevis GC procentuālo daudzumu, 52,6. Kļūdaini izmantojot procentuālo vērtību, iegūst Tm aptuveni 143 °C, kas nav reālistiska vērtība PCR reakcijai, kura notiek temperatūrā no 50 °C līdz 95 °C.

Kā izmantot šo kalkulatoru

Ievadiet vai ielīmējiet praimeru sekvenci, izmantojot tikai burtus A, T, G un C. Kalkulators parāda sekvences garumu nukleotīdos (nt), GC saturu procentos un aprēķināto atkvēlināšanas temperatūru Celsija grādos. Rezultātu var nokopēt laboratorijas piezīmēm vai protokolam.

PCR atkvēlināšanas temperatūras izvēle

Tm ir aprēķināts novērtējums, nevis garantēta darba temperatūra. Daudzi PCR protokoli faktisko atkvēlināšanas posmu sāk dažus grādus zem aprēķinātās Tm un pēc tam temperatūru koriģē, ņemot vērā gēlā iegūto rezultātu. Praimeru pārim par sākumpunktu parasti izmanto tā praimerа Tm, kurai ir zemākā vērtība. Gradientu PCR, kurā vienlaikus veic vairākas reakcijas dažādā temperatūru diapazonā, ir izplatīts veids, kā testējot atrast piemērotāko temperatūru.

Citi Tm aprēķināšanas veidi

Šeit izmantotās Marmura–Doti un Vollesa formulas ir ātras aptuvenas metodes, kas balstās tikai uz bāzu sastāvu. Pastāv arī citas metodes:

• Blakus esošo nukleotīdu pāru termodinamika ņem vērā to, kā katrs blakus esošo bāzu pāris ietekmē stabilitāti, un standarta praimeriem to uzskata par precīzāko metodi.
• Formulas ar sāļu koncentrācijas korekciju papildina aprēķinu ar korekciju, kas ņem vērā Na+ vai K+ jonu koncentrāciju reakcijas buferšķīdumā, jo lielāka sāls koncentrācija stabilizē DNS dupleksu un paaugstina Tm.

Dažādi kalkulatori vienam un tam pašam praimerim var uzrādīt atšķirīgas Tm vērtības, jo tie izmanto dažādas formulas. Galīgā pārbaude joprojām ir PCR veikšana un rezultāta pārbaude.

Biežāk uzdotie jautājumi

Kas ir DNS atkvēlināšanas temperatūra?

Tā ir temperatūra, kurā DNS praimeri PCR laikā piesaistās savai atbilstošajai sekvencei uz matricas virknes. Laboratorijās to parasti iestata dažus grādus zem praimerа aprēķinātās kušanas temperatūras (Tm).

Kā aprēķina praimeru Tm?

Praimeriem, kuru garums ir 14 bāzes vai lielāks, Tm = 64,9 + 41 × (GC skaits − 16,4) / garums. Praimeriem, kas ir īsāki par 14 bāzēm, Tm = 2 × (A+T skaits) + 4 × (G+C skaits).

Kāpēc GC saturs paaugstina Tm?

G-C bāzu pāri veido trīs ūdeņraža saites, salīdzinot ar divām A-T pāriem. Praimerim ar lielāku G un C bāzu īpatsvaru nepieciešams vairāk enerģijas un līdz ar to augstāka temperatūra, lai atdalītos no mērķa.

Vai PCR atkvēlināšanas temperatūrai jābūt vienādai ar aprēķināto Tm?

Nē. Lielākā daļa protokolu sāk ar temperatūru, kas ir vairākus grādus zem aprēķinātās Tm, un pēc tam to koriģē, jo Tm apzīmē punktu, kurā saistīta ir tikai puse praimeru.

Vai praimeru garums maina Tm?

Jā, lai gan ne vienkāršā veidā. Marmura–Doti formulā garums atrodas saucējā, tāpēc garākam praimerim ar vidēju GC saturu Tm automātiski nav augstāka nekā īsākam praimerim ar augstu GC saturu.

Kāpēc dažādi Tm kalkulatori sniedz atšķirīgus rezultātus?

Tie izmanto dažādas formulas. Vollesa likums, Marmura–Doti GC satura formula, blakus esošo nukleotīdu pāru termodinamika un formulas ar sāļu koncentrācijas korekciju vienam un tam pašam praimerim var dot atšķirīgu Tm, dažkārt ar vairāku grādu starpību.

Atsauces

1. Marmur J, Doty P. Dezoksiribonukleīnskābes bāzu sastāva noteikšana pēc tās termiskās denaturācijas temperatūras. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Sintētisko oligodeoksiribonukleotīdu hibridizācija ar phi chi 174 DNS. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Polimēru, hanteles formas un oligonukleotīdu DNS tuvāko kaimiņu termodinamikas vienots skatījums. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.