Olbaltumvielu Koncentrācijas Kalkulators | A280 līdz mg/mL

Olbaltumvielu koncentrācijas kalkulators

Olbaltumvielu koncentrācijas kalkulators pārvērš spektrofotometra gaismas absorbcijas rādījumu par šķīdumā izšķīdušo olbaltumvielu daudzumu. Rezultātu parasti izsaka miligramos mililitrā (mg/mL) vai mikrogramos mililitrā (μg/mL). Aprēķina pamatā ir Bēra–Lamberta likums — ķīmijā izmantota sakarība, kas saista parauga absorbētās gaismas daudzumu ar tajā esošās vielas daudzumu.

Kā mēra olbaltumvielu koncentrāciju

Lielākā daļa olbaltumvielu spēcīgi absorbē ultravioleto gaismu pie 280 nanometru (nm) viļņa garuma. Šo absorbciju galvenokārt izraisa divas olbaltumvielu struktūrā esošas aminoskābes — triptofāns un tirozīns. Spektrofotometrs izstaro gaismu caur paraugu un mēra, cik daudz gaismas paraugs absorbē. Šo rādījumu sauc par absorbanci jeb A280, ja mērījums veikts pie 280 nm.

Absorbances mērīšana pie 280 nm ir ātra un neiznīcina paraugu. Tādējādi tā atšķiras no ķīmiskām metodēm, piemēram, Bredforda vai BCA testa, kas aprakstīti turpmāk. Metode vislabāk darbojas ar attīrītu olbaltumvielu šķīdumā, ja absorbances rādījums ir aptuveni no 0,1 līdz 1,0. Rādījumi ārpus šī diapazona ir mazāk uzticami, tāpēc pirms mērīšanas paraugs bieži jāatšķaida.

Olbaltumvielu koncentrācijas formula

Kalkulators pārveido Bēra–Lamberta likumu, lai aprēķinātu koncentrāciju:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — olbaltumvielu koncentrācija mg/mL
• A — absorbance pie 280 nm (skaitlis bez mērvienības)
• DF — atšķaidīšanas koeficients, tas ir, cik reižu sākotnējais paraugs tika atšķaidīts pirms mērīšanas
• ε — ekstinkcijas koeficients, konkrētai olbaltumvielai raksturīga konstante, L/(g·cm)
• l — optiskais ceļš, attālums, ko gaisma veic caur paraugu, cm (standarta kivetē parasti 1 cm; kivete ir neliels stikla vai plastmasas trauks, ko izmanto spektrofotometrā)

Lai rezultātu pārvērstu mikrogramos mililitrā, vērtība mg/mL jāreizina ar 1 000. Lai noteiktu kopējo olbaltumvielu masu paraugā, koncentrācija jāreizina ar parauga tilpumu mililitros.

Aprēķina piemērs

Parauga absorbances rādījums pie 280 nm ir 0,5. Tas netika atšķaidīts, tāpēc atšķaidīšanas koeficients ir 1, un mērījums tika veikts standarta 1 cm kivetē. Olbaltumviela ir liellopu seruma albumīns (BSA), kura ekstinkcijas koeficients ir 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

1 mL paraugā tas ir aptuveni 0,75 mg kopējo olbaltumvielu jeb 750 μg/mL.

Bieži sastopamu olbaltumvielu ekstinkcijas koeficienti

Katra olbaltumviela absorbē gaismu atšķirīgi, jo katrai ir atšķirīgs triptofāna un tirozīna atlikumu skaits. Ekstinkcijas koeficients raksturo konkrētas olbaltumvielas absorbciju pie 280 nm, un to izsaka L/(g·cm). Bieži izmanto šādas vērtības:

Kalkulators var pieņemt arī pielāgotu ekstinkcijas koeficientu olbaltumvielai, kas nav šajā sarakstā. Olbaltumvielai ar zināmu aminoskābju secību šo vērtību var aprēķināt, izmantojot Gila un fon Hipela publicēto formulu 1989: ε₂₈₀ = (triptofāna atlikumi × 5 500) + (tirozīna atlikumi × 1 490) + (cistīna atlikumi × 125). Šī formula dod rezultātu M⁻¹cm⁻¹ — molārajā mērvienībā, kas atšķiras no iepriekš norādītajām uz masas bāzes izteiktajām L/(g·cm) vērtībām. Bezmaksas rīki, piemēram, ProtParam, ko nodrošina ExPASy serveris, šo vērtību aprēķina tieši no olbaltumvielas secības.

Optiskais ceļš un atšķaidīšanas koeficients

Optiskais ceļš ir kivetē esošā parauga platums, ko mēra centimetros. Standarta kivetes ir 1 cm platas. Mikrotilpuma spektrofotometri, kas mēra ļoti mazus paraugus, var izmantot daudz īsāku optisko ceļu, piemēram, 0,1 cm.

Atšķaidīšanas koeficients ņem vērā jebkādu pirms mērīšanas veikto atšķaidīšanu. Ja koncentrēts paraugs dotu absorbanci virs 1,0, to parasti vispirms atšķaida ar buferšķīdumu. Atšķaidīšanas koeficients ir kopējā atšķaidītā tilpuma attiecība pret sākotnējo parauga tilpumu. Piemēram, sajaucot 10 μL parauga ar 990 μL buferšķīduma, kopējais tilpums ir 1 000 μL un atšķaidīšanas koeficients ir 100.

Citi olbaltumvielu koncentrācijas mērīšanas veidi

Absorbance pie 280 nm ir viena no vairākām laboratorijā bieži izmantotām metodēm.

• Bredforda tests: izmanto krāsvielu, kas, saistoties ar olbaltumvielām, maina krāsu. Tas labi darbojas ar neattīrītiem paraugiem, taču krāsas maiņa dažādām olbaltumvielām var atšķirties.
• BCA tests: balstās uz krāsas maiņu, ko izraisa olbaltumvielu peptīdsaites. Tas ir saderīgs ar daudziem mazgāšanas līdzekļiem, taču tā veikšana aizņem vairāk laika nekā tiešs absorbances mērījums.
• Lourija metode: vecāka metode, kas ir ļoti jutīga, bet slikti reaģē ar dažām bieži izmantotām buferšķīduma sastāvdaļām.

Visas šīs trīs metodes iznīcina paraugu. Tiešs A280 mērījums to neiznīcina, tāpēc to pašu paraugu var atgūt un izmantot atkārtoti.

Biežāk uzdotie jautājumi

Kāds ir šai metodei piemērotākais absorbances diapazons?

No 0,1 līdz 1,0. Zem 0,1 rādījums ir neprecīzs. Virs 1,0 sakarība starp absorbanci un koncentrāciju var vairs nebūt lineāra, tāpēc paraugs vispirms jāatšķaida.

Kāpēc mērīt pie 280 nm, nevis pie 260 nm?

Nukleīnskābes, piemēram, DNS un RNS, spēcīgi absorbē gaismu pie 260 nm. Olbaltumvielas vairāk absorbē pie 280 nm, jo to sastāvā ir triptofāns un tirozīns. Mērīšana pie 280 nm samazina paraugā esošo nukleīnskābju radītos traucējumus.

Kā nosaka ekstinkcijas koeficientu olbaltumvielai, kas nav sarakstā?

Olbaltumvielai ar zināmu secību to aprēķina ar tādu rīku kā ProtParam pēc triptofāna, tirozīna un cistīna atlikumu skaita. To var arī izmērīt tieši, salīdzinot parauga absorbanci ar zināmas koncentrācijas šķīduma absorbanci.

Vai šī metode darbojas ar olbaltumvielu maisījumu?

Tā vislabāk darbojas ar vienu attīrītu olbaltumvielu, kurai zināms ekstinkcijas koeficients. Nezināmu olbaltumvielu maisījumu, piemēram, šūnu lizātu, parasti mēra ar Bredforda vai BCA testu, jo šīs metodes sniedz konsekventāku kopējo olbaltumvielu daudzuma novērtējumu.

Vai mazgāšanas līdzekļi var traucēt rādījumu?

Jā. Daudzi mazgāšanas līdzekļi absorbē gaismu tuvu 280 nm, kas var izkropļot rezultātu. Tukša parauga izmantošana, kurā ir tāda pati mazgāšanas līdzekļa koncentrācija, palīdz novērst šo fona absorbanci. Ļoti augstas mazgāšanas līdzekļa koncentrācijas gadījumā tā vietā var būt nepieciešams ar mazgāšanas līdzekļiem saderīgs tests, piemēram, BCA tests.