qPCR efektivitātes kalkulators: Standarta līknes analīzes rīks

qPCR efektivitātes kalkulators

qPCR efektivitātes kalkulators aplēš, cik labi kvantitatīvās PCR (qPCR) reakcija katrā amplifikācijas ciklā kopē mērķa DNS sekvenci. Tas izmanto Ct vērtības (cikla numuru, kurā fluorescences signāls šķērso noteiktu slieksni) no atšķaidījumu sērijas, lai aprēķinātu efektivitāti, slīpumu, brīvo locekli un R².

Kas ir qPCR efektivitāte?

Kvantitatīvā PCR seko fluorescences izmaiņām, reakcijai ciklu pa ciklam kopējot mērķa DNS sekvenci. Amplifikācijas efektivitāte raksturo, cik lielā mērā mērķa DNS daudzums palielinās katrā ciklā. Pie 100% efektivitātes mērķa DNS daudzums katrā ciklā dubultojas.

Reālas reakcijas reti sasniedz tieši 100%. Vairums laboratoriju par pieņemamu uzticamai kvantifikācijai uzskata efektivitāti no 90% līdz 110%. Vērtība zem 90% vai virs 110% liecina par problēmu, piemēram, nepiemērotu praimeru dizainu, PCR inhibitoriem, kas pārnesti no parauga ekstrakcijas, vai pipetēšanas kļūdām atšķaidījumu sērijā.

Efektivitātei ir vislielākā nozīme, salīdzinot gēnu ekspresiju dažādos paraugos. Izplatītā ΔΔCt metode reizes izmaiņu aprēķināšanai pieņem, ka katra reakcija notiek ar 100% efektivitāti. Ja izmērītā efektivitāte atšķiras no 100% vai mērķa gēnam un references gēnam ir atšķirīga efektivitāte, reizes izmaiņu rezultāti var būt neprecīzi.

qPCR efektivitātes formula

Efektivitāti aprēķina pēc standartlīknes slīpuma — līnijas, ko iegūst, attēlojot Ct vērtības pret sākotnējā DNS daudzuma bāzes-10 logaritmu (log10) atšķaidījumu sērijā.

E = 10^(-1/slīpums) - 1

E ir efektivitāte, kas izteikta kā decimāldaļa (procentiem to reizina ar 100). Slīpums ir standartlīknes līnijas slīpums. Tas ir negatīvs, jo Ct palielinās, samazinoties sākotnējam DNS daudzumam.

Slīpums -3,32 atbilst 100% efektivitātei:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Tas ir tāpēc, ka 10 reižu atšķaidījumam Ct vajadzētu mainīties par aptuveni 3,32 cikliem, ja reakcijā DNS daudzums katrā ciklā dubultojas, jo log2(10) ir aptuveni 3,32.

Praksē par pieņemamu uzskata slīpumu no -3,1 līdz -3,6. Šis diapazons atbilst aptuveni 90% līdz 110% efektivitātei. Slīpums, kas ir tuvāks -3,1, dod augstāku aprēķināto efektivitāti; slīpums, kas ir tuvāks -3,6, dod zemāku efektivitāti.

Kā aprēķināt qPCR efektivitāti: standartlīknes metode

1. Sagatavo atšķaidījumu sēriju. Sāc ar viskoncentrētāko paraugu un katram nākamajam paraugam to atšķaidi ar nemainīgu koeficientu, parasti 10 reizes. Veic qPCR katram atšķaidījumam un reģistrē tā Ct vērtību.
2. Pārvērt katru atšķaidījumu log10 vērtībā. Pirmo, viskoncentrētāko paraugu uzskatot par pozīciju 0, parauga numuram i log10(relatīvais daudzums) ir vienāds ar -i × log10(atšķaidījuma koeficients).
3. Katram atšķaidījumam attēlo Ct (vertikālā ass) pret log10 vērtību (horizontālā ass) un veic lineāro regresiju.
4. Nolasi regresijas līnijas slīpumu, brīvo locekli un R².
5. Ievieto slīpumu formulā E = 10^(-1/slīpums) - 1, lai iegūtu efektivitāti.

Standartlīknes kvalitātes kritēriji

• R² vismaz 0,98. Tas mēra, cik labi punkti atbilst taisnei. Zemāka vērtība bieži liecina par pipetēšanas kļūdām vai nevienmērīgu amplifikāciju.
• Slīpums no -3,1 līdz -3,6. Šis diapazons atbilst 90–110% efektivitātei.
• Vismaz trīs atšķaidījumu punkti. Pieci vai seši punkti nodrošina uzticamāku līniju un atvieglo novirzes punkta pamanīšanu.
• Viskoncentrētākajam paraugam Ct vajadzētu būt aptuveni 15-20. Visvairāk atšķaidītā parauga Ct jābūt zemākam par 35, jo lielākas vērtības tuvojas noteikšanas robežai.

Aprēķina piemērs

Piecu punktu 10 reižu atšķaidījumu sērija dod šādas Ct vērtības, sākot ar viskoncentrētāko un beidzot ar vismazāk koncentrēto paraugu: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

log10(relatīvais daudzums) vērtības ir 0, -1, -2, -3, -4, jo katrs atšķaidīšanas solis pievieno -log10(10), proti, -1. Ct katrā solī palielinās par 3,5 cikliem, tāpēc punkti atrodas uz taisnes un lineārā regresija dod:

• Slīpums: -3,5
• Brīvais loceklis: 15,0
• R²: 1,0

Efektivitāte: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931 jeb aptuveni 93%.

Efektivitāte 93% ar R² = 1,0 atbilst standarta kvalitātes kritērijiem un ir piemērota gēnu ekspresijas kvantifikācijai.

Koda piemērs

Šī JavaScript funkcija izmanto tādu pašu metodi kā kalkulators. Pirms logaritma aprēķināšanas katras Ct vērtības indeksu padara negatīvu, jo pirmajam, viskoncentrētākajam paraugam ir vislielākais relatīvais daudzums un katrs nākamais paraugs ir vairāk atšķaidīts.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Kāpēc efektivitātei ir nozīme gēnu ekspresijā

Reizes izmaiņu aprēķini, tostarp ΔΔCt metode, pieņem, ka katrā ciklā reakcija dubulto mērķa daudzumu. Ja mērķa gēnam un references gēnam ir atšķirīga izmērītā efektivitāte, vienkāršā ΔΔCt formula rada kļūdu. Ja efektivitātes atšķiras par vairāk nekā aptuveni pieciem procentpunktiem, pētnieki bieži pāriet uz efektivitāti koriģējošu aprēķinu, piemēram, uz metodi, ko Michael Pfaffl aprakstīja 2001. MIQE vadlīnijas — plaši citēts qPCR ziņošanas standartu kopums, kas publicēts 2009 — iesaka pētījumos līdztekus kvantifikācijas rezultātiem ziņot aprēķināto efektivitāti, slīpumu un R².

Biežāk uzdotie jautājumi

Kāds qPCR efektivitātes procents ir labs?

Parasti par pieņemamu uzskata efektivitāti no 90% līdz 110%, bet labi optimizētām analīzēm tā ir aptuveni 95–105%. Slīpums -3,32 atbilst tieši 100%.

Kāpēc mana qPCR efektivitāte pārsniedz 110%?

Biežākie iemesli ir pipetēšanas kļūdas atšķaidījumu sērijā, praimeru dimēri, inhibitori, kas nevienmērīgi ietekmē koncentrētus un atšķaidītus paraugus, vai fluorescences slieksnis, kas iestatīts ārpus amplifikācijas eksponenciālās fāzes. Kušanas līkne ar vairāk nekā vienu pīķi var liecināt par praimeru dimēriem.

Kāpēc mana qPCR efektivitāte ir zemāka par 90%?

Iespējamie iemesli ir nepiemērots praimeru dizains, PCR inhibitori, kas pārnesti no parauga ekstrakcijas, vai neoptimāla piesaistes temperatūra. Praimeru specifiskuma pārbaude un temperatūras gradienta izmantošana var palīdzēt noteikt cēloni.

Ko nozīmē zema R² vērtība?

R² mēra, cik labi Ct vērtības atbilst taisnei attiecībā pret logaritmisko daudzumu. Vērtība zem 0,98 liecina par nevienmērīgu pipetēšanu, inhibētu paraugu vai atšķaidījuma punktu, kas atrodas tuvu noteikšanas robežai.

Cik atšķaidījumu punktu vajag standartlīknei?

Vismaz trīs — tas ir lineārajai regresijai nepieciešamais minimums. Pieci vai seši punkti dod uzticamāku slīpumu un atvieglo noviržu pamanīšanu.

Vai efektivitāte var mainīties starp eksperimentiem?

Jā. Jauna reaģentu partija, jauna praimeru partija, cita veida paraugs vai cita qPCR ierīce var mainīt efektivitāti. Daudzas laboratorijas atkārtoti pārbauda efektivitāti ik pēc dažiem mēnešiem vai ar katru jaunu reaģentu partiju.

Atsauces

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA u. c. MIQE vadlīnijas: minimālā informācija kvantitatīvās reāllaika PCR eksperimentu publicēšanai. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Jauns matemātisks modelis relatīvai kvantifikācijai reāllaika RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Cik labs ir PCR efektivitātes novērtējums: ieteikumi precīzai un uzticamai qPCR efektivitātes novērtēšanai. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.