Aprēķiniet PCR efektivitāti no Ct vērtībām un atšķaidīšanas faktoriem. Analizējiet standarta līknes, nosakiet amplifikācijas efektivitāti un validējiet savus kvantitatīvos PCR eksperimentus.
Vērtībai jābūt pozitīvai
Vērtībai jābūt pozitīvai
Vērtībai jābūt pozitīvai
Vērtībai jābūt pozitīvai
Vērtībai jābūt pozitīvai
Ievadiet derīgus datus, lai ģenerētu diagrammu
qPCR efektivitāte ir mērījums tam, cik labi PCR reakcija darbojas. Efektivitāte 100% nozīmē, ka PCR produkta daudzums dubultojas katrā ciklā eksponenciālajā fāzē.
Efektivitāte tiek aprēķināta no standarta līknes slīpuma, kas iegūta, zīmējot Ct vērtības pret sākotnējās šablona koncentrācijas logaritmu (atšķaidījumu sērija).
Efektivitāte (E) tiek aprēķināta, izmantojot formulu:
E = 10^(-1/slope) - 1
Kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija (qPCR) efektivitāte ir kritisks parametrs, kas tieši ietekmē jūsu qPCR eksperimentu precizitāti un uzticamību. qPCR efektivitātes kalkulators palīdz pētniekiem noteikt, cik efektīvi viņu PCR reakcijas amplificē mērķa DNS secības katrā termiskajā ciklā. Ideālām qPCR reakcijām jābūt efektivitātei no 90-110%, kas norāda, ka PCR produkta daudzums aptuveni dubultojas katrā ciklā eksponenciālajā fāzē.
Slikta amplifikācijas efektivitāte var novest pie neprecīzas kvantifikācijas, neuzticamiem rezultātiem un kļūdainiem eksperimentāliem secinājumiem. Aprēķinot un uzraugot savu qPCR efektivitāti, jūs varat optimizēt reakcijas apstākļus, validēt primāru dizainus un nodrošināt kvantitatīvā PCR datu kvalitāti.
Šis kalkulators izmanto standarta līknes metodi, kas attēlo cikla sliekšņa (Ct) vērtības pret parauga koncentrācijas logaritmu (ko pārstāv sērijveida atšķaidījumi), lai noteiktu jūsu qPCR analīzes efektivitāti. Iegūtā slīpuma vērtība no šīs standarta līknes tiek izmantota, lai aprēķinātu amplifikācijas efektivitāti, izmantojot vienkāršu matemātisku formulu.
qPCR reakcijas efektivitāte tiek aprēķināta no standarta līknes slīpuma, izmantojot sekojošo formulu:
Kur:
Ideālai PCR reakcijai ar 100% efektivitāti (perfekta amplifikācija ampliconiem katrā ciklā) slīpumam jābūt -3.32. Tas ir tāpēc:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (vai 100%)}
Efektivitātes procentuālais rādītājs tiek aprēķināts, reizinot decimāla efektivitāti ar 100:
\text{Efektivitāte (%)} = E \times 100\%
Standarta līkne tiek izveidota, attēlojot Ct vērtības (y-ass) pret sākotnējās parauga koncentrācijas vai atšķaidījuma faktora logaritmu (x-ass). Attiecībai starp šiem mainīgajiem jābūt lineārai, un šīs lineārās attiecības kvalitāti novērtē, izmantojot noteikšanas koeficientu (R²).
Lai nodrošinātu uzticamu qPCR efektivitātes aprēķinu:
Datu sagatavošana: Kalkulators ņem jūsu Ct vērtības katram atšķaidījuma punktam un atšķaidījuma faktoru kā ievadi.
Logaritmiskā transformācija: Atšķaidījuma sērija tiek transformēta logaritmiskā skalā (logaritms ar bāzi 10).
Lineārā regresija: Kalkulators veic lineārās regresijas analīzi uz log-transformatīviem datiem, lai noteiktu slīpumu, y-intercept un R² vērtību.
Efektivitātes aprēķins: Izmantojot slīpuma vērtību, efektivitāte tiek aprēķināta, izmantojot formulu E = 10^(-1/slope) - 1.
Rezultātu interpretācija: Kalkulators automātiski parāda efektivitāti procentos, kopā ar slīpumu un R² vērtību, lai palīdzētu jums novērtēt jūsu qPCR analīzes uzticamību.
Izpildiet šos soļus, lai aprēķinātu savu qPCR efektivitāti:
Iestatiet atšķaidījumu skaitu: Izvēlieties, cik daudz atšķaidījuma punktu jums ir savā standarta līknes (ieteicams no 3-7 punktiem).
Ievadiet atšķaidījuma faktoru: Ievadiet atšķaidījuma faktoru, ko izmantojat starp secīgiem paraugiem (piemēram, 10 desmitkārtīgai atšķaidīšanai, 5 pieciniekam).
Ievadiet Ct vērtības: Ievadiet Ct vērtības katram atšķaidījuma punktam. Parasti pirmajā atšķaidījumā (Atšķaidījums 1) ir visaugstākais parauga koncentrācija, kas noved pie zemākās Ct vērtības.
Skatīt rezultātus: Kalkulators automātiski aprēķinās un parādīs:
Interpretēt rezultātus: Novērtējiet, vai jūsu qPCR efektivitāte ir pieņemamajā diapazonā (90-110%) un vai R² vērtība norāda uz uzticamu standarta līkni (≥ 0.98).
Kopēt rezultātus: Izmantojiet pogu "Kopēt rezultātus", lai kopētu visus aprēķinātos vērtības saviem ierakstiem vai publikācijām.
Pastaigāsim cauri piemēram:
Kad tas tiek attēlots uz standarta līknes:
Kalkulators veiks lineāro regresiju un noteiks:
Izmantojot efektivitātes formulu:
Tas norāda uz labu qPCR efektivitāti 93%, kas ietilpst pieņemamajā diapazonā no 90-110%.
Pirms jauna primāru pāra izmantošanas kvantitatīvos eksperimentus ir būtiski validēt tā veiktspēju. qPCR efektivitātes aprēķins palīdz:
Jaunu qPCR analīžu izstrādē efektivitātes aprēķini ir būtiski:
Relatīvās kvantifikācijas eksperimentu gadījumā, zinot PCR efektivitāti, ir būtiski:
Klīniskajās un diagnostikas vidēs qPCR efektivitāte ir svarīga:
Vides un pārtikas drošības lietojumos efektivitātes aprēķini palīdz:
Lai gan standarta līknes metode ir visizplatītākā pieeja qPCR efektivitātes aprēķināšanai, ir pieejamas alternatīvas metodes:
Šī metode aprēķina efektivitāti no fluorescences datiem par vienu amplifikācijas līkni, neprasot atšķaidījumu sēriju. Programmatūra, piemēram, LinRegPCR, analizē individuālo reakciju eksponenciālo fāzi, lai noteiktu efektivitāti.
Priekšrocības:
Trūkumi:
Digitālā PCR (dPCR) nodrošina absolūtu kvantifikāciju, neprasot standarta līkni vai efektivitātes aprēķinus.
Priekšrocības:
Trūkumi:
Dažas qPCR analīzes programmatūras piedāvā salīdzinošas kvantifikācijas metodes, kas novērtē efektivitāti bez pilnīgas standarta līknes.
Priekšrocības:
Trūkumi:
qPCR un efektivitātes aprēķinu attīstība ir ievērojami attīstījusies pēdējo divu desmitgažu laikā:
Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) tika izgudrota Kary Mullis 1983. gadā, revolucionizējot molekulāro bioloģiju. Tomēr tradicionālā PCR bija tikai kvalitatīva vai puskvantitatīva. Pirmais reāllaika PCR sistēma tika izstrādāta 1990. gados, kad Russell Higuchi un kolēģi parādīja, ka PCR produktu uzkrāšanās uzraudzība (izmantojot etidija bromīda fluorescenci) var sniegt kvantitatīvu informāciju.
Līdz ar qPCR tehnoloģijas attīstību pētnieki atzina standartizācijas un validācijas nozīmi. PCR efektivitātes koncepts kļuva centrāls uzticamas kvantifikācijas nodrošināšanai:
Joma ir turpinājusi attīstīties ar:
Mūsdienās qPCR efektivitātes aprēķināšana un ziņošana tiek uzskatīta par būtisku, publicējot uzticamus qPCR datus, un šādi kalkulatori palīdz pētniekiem ievērot labākās prakses jomā.
1' Excel formula qPCR efektivitātes aprēķināšanai no slīpuma
2' Novietojiet šūnā B2, ja slīpums ir šūnā A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel formula, lai pārvērstu efektivitāti procentos
6' Novietojiet šūnā C2, ja efektivitātes decimāldaļa ir šūnā B2
7=B2*100
8
9' Funkcija efektivitātes aprēķināšanai no Ct vērtībām un atšķaidījuma faktora
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Veic lineāro regresiju
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Aprēķina slīpumu
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Aprēķina efektivitāti
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R funkcija qPCR efektivitātes aprēķināšanai no Ct vērtībām un atšķaidījuma faktora
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Izveido log atšķaidījuma vērtības
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Veic lineāro regresiju
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Iegūst slīpumu un R-kvadrātu
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Aprēķina efektivitāti
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Atgriež rezultātus
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Piemēra izmantošana
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Efektivitāte: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Slīpums: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadrāts: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Aprēķina qPCR efektivitāti no Ct vērtībām un atšķaidījuma faktora.
8
9 Parametri:
10 ct_values (list): Ct vērtību saraksts
11 dilution_factor (float): Atšķaidījuma faktors starp secīgiem paraugiem
12
13 Atgriež:
14 dict: Vārdu kopums, kas satur efektivitāti, slīpumu, r_kvadrātu un intercept
15 """
16 # Izveido log atšķaidījuma vērtības
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Veic lineāro regresiju
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Aprēķina efektivitāti
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Attēlo standarta līkni ar regresijas līniju.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Izveido punktus regresijas līnijai
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Atšķaidījums')
48 plt.ylabel('Ct Vērtība')
49 plt.title('qPCR Standarta Līkne')
50
51 # Pievieno vienādojumu un R² uz grafika
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Efektivitāte = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Piemēra izmantošana
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Efektivitāte: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Slīpums: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadrāts: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Attēlot standarta līkni
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Aprēķina qPCR efektivitāti no Ct vērtībām un atšķaidījuma faktora
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct vērtību masīvs
4 * @param {number} dilutionFactor - Atšķaidījuma faktors starp secīgiem paraugiem
5 * @returns {Object} Objekts, kas satur efektivitāti, slīpumu, rKvadrātu un intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Izveido log atšķaidījuma vērtības
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Aprēķina vidējos rādītājus lineārajai regresijai
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Aprēķina slīpumu un intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Aprēķina R-kvadrātu
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Aprēķina efektivitāti
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Piemēra izmantošana
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Efektivitāte: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Slīpums: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadrāts: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Laba qPCR efektivitāte parasti ir no 90% līdz 110% (0.9-1.1). Efektivitāte 100% apzīmē perfektu amplifikāciju katrā ciklā. Efektivitātes vērtības ārpus šī diapazona var norādīt uz problēmām ar primāru dizainu, reakcijas apstākļiem vai inhibitoru klātbūtni.
Efektivitātes vērtības, kas ir lielākas par 100%, var rasties sakarā ar:
Zema R² vērtība (zem 0.98) norāda uz sliktu linearitāti jūsu standarta līknē, kas var būt izraisīta no:
Lai nodrošinātu uzticamus efektivitātes aprēķinus, ir nepieciešami vismaz 3 atšķaidījuma punkti, taču ieteicams izmantot 5-6 punktus precīzākiem rezultātiem. Šiem punktiem jāaptver viss gaidāmais parauga koncentrāciju diapazons jūsu eksperimentālajos paraugos.
Relatīvās kvantifikācijas, izmantojot ΔΔCt metodi, tiek pieņemts, ka mērķa un atsauces gēnu efektivitātes ir vienādas (ideāli 100%). Ja efektivitātes būtiski atšķiras:
Nē, efektivitāte jānosaka katram primāru pārim un jāvalidē atkārtoti:
PCR inhibitori var:
Termini bieži tiek lietoti savstarpēji aizvietojami, taču:
Lai uzlabotu qPCR efektivitāti:
Salīdzināt paraugus ar būtiski atšķirīgām efektivitātēm nav ieteicams, jo:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE vadlīnijas: minimālā informācija kvantitatīvo reāllaika PCR eksperimentu publicēšanai. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. Jauns matemātiskais modelis relatīvai kvantifikācijai reāllaika RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Cik laba ir PCR efektivitātes novērtējums: Ieteikumi precīzai un uzticamai qPCR efektivitātes novērtēšanai. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Ultimātā qPCR eksperimenta: Publicējamu kvalitatīvu, reproducējamu datu iegūšana pirmo reizi. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplifikācijas efektivitāte: saistot bāzes līmeni un novirzi kvantitatīvo PCR datu analīzē. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetiskā PCR analīze: reāllaika PCR amplifikācijas reakciju uzraudzība. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Reāllaika PCR Lietojumu Ceļvedis. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Reāllaika PCR Rokasgrāmata. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Mūsu qPCR Efektivitātes Kalkulators nodrošina vienkāršu, bet jaudīgu rīku pētniekiem, lai validētu un optimizētu savus kvantitatīvā PCR eksperimentus. Precīzi aprēķinot efektivitāti no standarta līknēm, jūs varat nodrošināt uzticamu kvantifikāciju, novērst problēmas analīzēs un ievērot labākās prakses kvantitatīvā PCR eksperimentēšanā.
Izmēģiniet mūsu kalkulatoru šodien, lai uzlabotu savu qPCR datu kvalitāti un uzticamību!
Atklājiet vairāk rīku, kas varētu būt noderīgi jūsu darbplūsmai