DNS Koncentrācijas Kalkulators

DNS koncentrācijas kalkulators pārvērš UV absorbcijas rādījumu pie 260 nanometru viļņa garuma, ko sauc par A260, DNS koncentrācijā nanogramos uz mikrolitru (ng/µL). Tas arī nosaka kopējo DNS daudzumu paraugā mikrogramos (µg).

Kas ir A260 absorbcija?

A260 ir ultravioletās gaismas daudzums, ko šķīdums absorbē pie 260 nanometru viļņa garuma. DNS šo UV gaismu absorbē visintensīvāk šī viļņa garuma tuvumā savu nukleotīdu bāzu dēļ. Spektrofotometrs nosaka A260 pēc tukšā parauga mērījuma, kurā izmantots tas pats buferšķīdums, kas paraugā, tādējādi novēršot fona absorbciju. Jo vairāk DNS ir šķīdumā, jo lielāks ir A260 rādījums.

DNS koncentrācijas formula

Divpavedienu DNS absorbē UV gaismu proporcionāli tās koncentrācijai; šo sakarību sauc par Bēra–Lamberta likumu. Standarta 1 centimetra gaismas ceļā šķīdums ar A260 rādījumu 1,0 satur aptuveni 50 ng/µL divpavedienu DNS. Šis skaitlis jeb pārrēķina koeficients pārvērš jebkuru A260 rādījumu koncentrācijā:

DNS koncentrācija (ng/µL) = A260 × 50 × atšķaidījuma koeficients

Atšķaidījuma koeficients ņem vērā jebkādu atšķaidīšanu, kas veikta pirms parauga mērīšanas. Paraugam, kas mērīts bez atšķaidīšanas, atšķaidījuma koeficients ir 1.

Kā aprēķināt kopējo DNS daudzumu

Kad koncentrācija ir zināma, kopējo DNS masu paraugā var noteikt pēc tā tilpuma:

Kopējais DNS daudzums (µg) = koncentrācija (ng/µL) × tilpums (µL) ÷ 1000

Kā aprēķināt DNS koncentrāciju: soli pa solim

Pirms mērīšanas rūpīgi samaisiet paraugu. DNS var pieķerties mēģenes sieniņām vai nevienmērīgi nosēsties.
Ja paraugs ir ļoti koncentrēts, to atšķaidiet, cenšoties panākt A260 rādījumu starp 0,1 un 1,0. Ārpus šī diapazona spektrofotometra rādījumi ir vismazāk uzticami.
Iestatiet spektrofotometra nulles rādījumu, izmantojot to pašu buferšķīdumu, kas izmantots atšķaidīšanai, pēc tam izmēriet paraugu pie 260 nm.
Ievadiet A260 rādījumu, parauga tilpumu un atšķaidījuma koeficientu kalkulatorā, lai iegūtu koncentrāciju un kopējo daudzumu. Lai tiktu parādīts rezultāts, jāaizpilda visi trīs lauki, un tilpumam jābūt lielākam par nulli.

Aprēķina piemērs

Piemērs 1: neatšķaidīts paraugs

A260 rādījums ir 0,5, atšķaidīšana nav veikta (atšķaidījuma koeficients 1), un parauga tilpums ir 100 µL.

Koncentrācija = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
Kopējais DNS daudzums = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Piemērs 2: atšķaidīts paraugs

Mēģenē ir 50 µL attīrītas DNS. Neliela tā daļa tika atšķaidīta 10 reizes, un atšķaidītās daļas A260 rādījums bija 0,75. Atšķaidījuma koeficients šo rādījumu pārrēķina uz koncentrāciju sākotnējā mēģenē, bet 50 µL ir tilpums, ko ievada kopējā daudzuma aprēķinam.

Koncentrācija = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
Kopējais DNS daudzums = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Atšķaidījuma koeficienta aprēķināšana

Atšķaidījuma koeficients = kopējais tilpums pēc atšķaidīšanas ÷ sākotnējā parauga tilpums.

Pievienojot 5 µL DNS šķīduma 45 µL buferšķīdumam, kopējais tilpums ir 50 µL, tāpēc atšķaidījuma koeficients ir 50 ÷ 5 = 10. Paraugam, kas nav atšķaidīts, atšķaidījuma koeficients ir 1.

Tipiski DNS koncentrācijas diapazoni

Koncentrācija ir atkarīga no parauga veida un ekstrakcijas metodes. Genomiskās DNS ekstraktu koncentrācija parasti ir aptuveni no 10 līdz 100 ng/µL. Plazmīdu DNS preparātiem koncentrācija bieži ir lielāka, dažkārt sasniedzot vairākus simtus ng/µL. Rezultāts, kas būtiski pārsniedz konkrētajai metodei paredzēto diapazonu vai ir zem tā, var liecināt par problēmu ekstrakcijā vai pašā mērījumā.

UV absorbcijas mērījumu ierobežojumi

A260 mērīšana ir ātra, taču tā nav jutīgākā vai specifiskākā DNS noteikšanas metode. Proteīni, RNS un daži buferšķīduma komponenti arī absorbē gaismu 260 nm tuvumā un var paaugstināt rādījumu. Lai pārbaudītu, vai paraugs nav piesārņots ar proteīniem, pētnieki bieži kopā ar koncentrāciju pārbauda A260/A280 attiecību; attiecība aptuveni 1,8 parasti liecina par tīru DNS paraugu. Metodes, kuru pamatā ir fluorescējošas krāsvielas, piemēram, Qubit testi, saistās tikai ar divpavedienu DNS un sniedz precīzāku rādījumu atšķaidītiem vai netīriem paraugiem, taču tām nepieciešami papildu reaģenti un fluorometrs.

Biežāk uzdotie jautājumi

Kā aprēķināt DNS koncentrāciju pēc A260?

Reiziniet A260 rādījumu ar 50, kas ir standarta pārrēķina koeficients divpavedienu DNS, pēc tam reiziniet ar atšķaidījuma koeficientu. Ja paraugs nav atšķaidīts, izmantojiet atšķaidījuma koeficientu 1.

Kāda ir laba A260/A280 attiecība?

Attiecība aptuveni 1,8 parasti liecina par tīru DNS paraugu. Mazāka attiecība norāda uz proteīnu piesārņojumu. Attiecība virs 2,0 var liecināt par RNS piesārņojumu.

Vai šo kalkulatoru var izmantot RNS aprēķiniem?

Ne tieši, jo RNS izmanto pārrēķina koeficientu 40 ng/µL, nevis 50. Lai aptuveni noteiktu RNS koncentrāciju, reiziniet kalkulatora rezultātu ar 0,8 (40 ÷ 50) vai tieši izmantojiet A260 × 40 × atšķaidījuma koeficientu.

Kāpēc A260 rādījumam jābūt starp 0,1 un 1,0?

Absorbcija aptuveni proporcionāli koncentrācijai saglabājas galvenokārt šajā diapazonā, kā aprakstīts ar Bēra–Lamberta likumu. Ārpus tā rādījumi kļūst mazāk uzticami, tāpēc pārāk koncentrēts vai pārāk atšķaidīts paraugs pirms atkārtotas mērīšanas jāatšķaida vai jākoncentrē.

Kāda ir atšķirība starp koncentrāciju un tīrību?

Koncentrācija raksturo DNS daudzumu, kas atrodas paraugā, ng/µL. Tīrība raksturo parauga tīrību, ko galvenokārt vērtē pēc absorbcijas attiecībām, piemēram, A260/A280. Paraugam var būt augsta koncentrācija un tas joprojām var būt netīrs, vai arī zema koncentrācija un ļoti augsta tīrība.

Kā pārvērst ng/µL uz µg/mL?

Abām mērvienībām skaitliskā vērtība ir vienāda. 1 ng/µL ir vienāds ar 1 µg/mL, jo gan masas, gan tilpuma mērvienība mainās ar koeficientu 1000.

Atsauces

Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. izdevums). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). DNS un RNS kvantitatīvā noteikšana ar absorbcijas un fluorescences spektroskopiju. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). A260/A280 attiecību nozīme nukleīnskābju tīrības noteikšanā. BioTechniques, 19(2), 208–210.

DNS Koncentrācijas Kalkulators | A260 uz ng/μL Pārveidotājs