DNS Ligācijas Kalkulators - Aprēķiniet Insert:Vektora Attiecības Molekulārajā Klonēšanā

DNS ligācija ir molekulārās klonēšanas posms, kurā inserta fragments tiek savienots ar plazmīdas vektoru, izmantojot enzīmu T4 DNS ligāzi. DNS ligācijas kalkulators aprēķina, cik mikrolitru inserta DNS un vektora DNS jāsajauc, lai reakcijā sasniegtu izvēlēto inserta un vektora molāro attiecību.

Ko dara kalkulators

Kalkulatoram nepieciešami seši ievaddati: vektora koncentrācija, vektora garums, inserta koncentrācija, inserta garums, mērķa inserta un vektora molārā attiecība un kopējais reakcijas tilpums. Lietotājs var arī norādīt izmantojamo vektora DNS daudzumu; pēc noklusējuma tas ir 50 nanogrami (ng). Izmantojot šīs vērtības, kalkulators aprēķina pipetēšanai nepieciešamo vektora tilpumu, inserta tilpumu un bufera vai ūdens daudzumu, kas jāpievieno, lai sasniegtu kopējo reakcijas tilpumu.

Koncentrāciju mēra nanogramos uz mikrolitru (ng/μL), parasti ar Nanodrop vai Qubit instrumentu. Garumu mēra bāzu pāros (bp). Viena kilobāze (kb) atbilst 1000 bāzu pāriem. Molārā attiecība norāda, cik inserta molekulu jābūt uz katru vienu vektora molekulu. Tā nav masas attiecība.

Kāpēc izmanto molāro attiecību, nevis masu

Vienādas DNS masas nesatur vienādu molekulu skaitu. Īss inserts sver mazāk nekā garš vektors ar tādu pašu molekulu skaitu. Sajaucot vienādu nanogramu daudzumu īsa inserta un gara vektora, inserta molekulu būtu pārāk maz salīdzinājumā ar vektora molekulām. Kalkulators pielāgo inserta masu, ņemot vērā fragmentu garumu attiecību, lai galīgajā maisījumā būtu paredzētais inserta molekulu skaits uz vienu vektora molekulu.

DNS ligācijas formula

Nepieciešamais inserta DNS daudzums nanogramos ir:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

kur $m_i$ ir inserta daudzums nanogramos, $m_v$ — vektora daudzums nanogramos, $k_i$ — inserta garums kilobāzu pāros, $k_v$ — vektora garums kilobāzu pāros, bet R — mērķa inserta un vektora molārā attiecība.

Kad šis daudzums ir zināms, kalkulators katru daudzumu pārvērš pipetēšanai piemērotā tilpumā:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

kur $V_v$ un $V_i$ ir attiecīgi vektora un inserta tilpums mikrolitros, $c_v$ un $c_i$ — attiecīgi vektora un inserta koncentrācija nanogramos uz mikrolitru, $V_b$ — bufera tilpums, bet $V_t$ — kopējais reakcijas tilpums.

Ja vektora un inserta tilpumu summa pārsniedz kopējo reakcijas tilpumu, buferim, ligāzei vai ūdenim vairs nav vietas. Šādā gadījumā kalkulators norāda, ka kopējais tilpums ir pārāk mazs, nevis uzrāda negatīvu bufera daudzumu.

Aprēķina piemērs

Pētnieks klonē 1 kb gēna fragmentu 3 kb plazmīdas vektorā. Plānots izmantot 50 ng vektora DNS ar inserta un vektora molāro attiecību 3:1, reakcijas tilpumam esot 20 μL.

Ievaddati:

• Vektora koncentrācija: 50 ng/μL
• Vektora garums: 3000 bp (3 kb)
• Inserta koncentrācija: 25 ng/μL
• Inserta garums: 1000 bp (1 kb)
• Molārā attiecība: 3
• Kopējais tilpums: 20 μL
• Vektora daudzums: 50 ng

Solis 1: inserta daudzums

Inserta ng = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Solis 2: tilpumi

Vektora tilpums = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Inserta tilpums = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Bufera tilpums = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reakcija sastāv no 1 μL vektora, 2 μL inserta un 17 μL bufera vai ūdens; šeit pievieno arī ligāzi un tās reakcijas buferi. Šajā maisījumā uz katru vektora molekulu ir trīs inserta molekulas.

Tipiskās molārās attiecības ligācijai

Lielākajā daļā standarta klonēšanas gadījumu, kad gali ir lipīgi un pārklājas, izmanto inserta un vektora molāro attiecību 3:1. Ligācijas, kurās savieno fragmentus ar neasiem galiem, ir mazāk efektīvas, tāpēc bieži izmanto lielāku attiecību, piemēram, 5:1. Ļoti lieli inserti dažkārt labāk darbojas ar mazāku attiecību, tuvāku 1:1, jo lieli fragmenti jau nodrošina daudz bāzu pāru uz vienu molekulu.

Biežāk uzdotie jautājumi

Kas ir DNS ligācija?

DNS ligācija ir divu DNS fragmentu, parasti plazmīdas vektora un inserta, savienošana vienā nepārtrauktā molekulā. Enzīms T4 DNS ligāze noslēdz savienojumu starp fragmentu galiem.

Ko nozīmē inserta un vektora molārā attiecība?

Tā ir reakcijā esošo inserta DNS molekulu skaits uz katru vienu vektora molekulu. Attiecība 3:1 nozīmē trīs inserta molekulas uz katru vektora molekulu neatkarīgi no to masas attiecības.

Kāpēc neizmantot vienādu nanogramu daudzumu vektoram un insertam?

Dažāda garuma DNS fragmentiem ir atšķirīga masa uz vienu molekulu. 1 kb inserts, rēķinot uz vienu molekulu, sver aptuveni trešdaļu no 3 kb vektora masas. Vienādi nanogramu daudzumi nesniegtu vienādu molekulu skaitu, tāpēc kalkulators pielāgo inserta masu, lai sasniegtu mērķa molāro attiecību.

Ko nozīmē, ja kopējais tilpums ir pārāk mazs?

Tas nozīmē, ka vektora un inserta tilpumi vien jau aizņem visu reakcijas tilpumu, neatstājot vietu buferim vai ligāzei. Risinājums ir palielināt kopējo reakcijas tilpumu vai izmantot koncentrētākus DNS izejas šķīdumus.

Vai šo kalkulatoru var izmantot Gibson Assembly vai Golden Gate klonēšanai?

Nē. Šajās metodēs izmanto citu reakcijas ķīmiju un parasti mērķē uz visu fragmentu ekvimolāriem daudzumiem, nevis fiksētu inserta un vektora attiecību. To tilpuma aprēķini atšķiras no standarta T4 ligāzes klonēšanas aprēķiniem.

Cik daudz vektora DNS parasti izmanto?

50 ng ir parasts sākuma daudzums standarta ligācijas reakcijai. Laboratorijas izmanto arī daudzumus no 25 līdz 100 ng, pielāgojot tos DNS koncentrācijai un reakcijas mērogam.