DNS Ligation Calculator

Ievads

DNS ligācija ir kritiska molekulārās bioloģijas tehnika, ko izmanto, lai pievienotu DNS fragmentus kopā ar kovalentām saitēm. DNS Ligation Calculator ir būtisks rīks pētniekiem, kas palīdz noteikt optimālos vektora un ievietošanas DNS daudzumus, kas nepieciešami veiksmīgām ligācijas reakcijām. Aprēķinot pareizās molārās attiecības starp vektoru (plazmidu) un ievietošanas DNS fragmentiem, šis kalkulators nodrošina efektīvas molekulārās klonēšanas eksperimentus, vienlaikus minimizējot izšķērdētos reaģentus un neveiksmīgās reakcijas.

Ligācijas reakcijas ir pamatprincipi ģenētiskajā inženierijā, sintētiskajā bioloģijā un molekulārās klonēšanas procedūrās. Tās ļauj zinātniekiem izveidot rekombinantus DNS molekulas, ievietojot interesējošos gēnus plazmidu vektoros turpmākai transformācijai uz saimniekorganismiem. Šo reakciju panākumi lielā mērā ir atkarīgi no pareizo DNS komponentu daudzumu izmantošanas, ko šis kalkulators palīdz noteikt.

Neatkarīgi no tā, vai jūs veidojat ekspresijas vektorus, izveidojat gēnu bibliotēkas vai veicat rutīnas subklonēšanu, šis DNS ligācijas kalkulators palīdzēs optimizēt jūsu eksperimentālos apstākļus un palielināt jūsu panākumu līmeni. Ievadot dažus galvenos parametrus par jūsu DNS paraugiem, jūs varat ātri iegūt precīzas tilpuma vērtības, kas nepieciešamas jūsu specifiskajai ligācijas reakcijai.

Formula/Aprēķins

DNS ligācijas kalkulators izmanto pamata molekulārās bioloģijas formulu, kas ņem vērā dažādos izmērus un koncentrācijas DNS fragmentiem, kas tiek apvienoti. Galvenais aprēķins nosaka, cik daudz ievietošanas DNS ir nepieciešams attiecībā pret vektora DNS, pamatojoties uz to attiecīgajiem garumiem un vēlamo molāro attiecību.

Ievietošanas daudzuma aprēķins

Nepieciešamais ievietošanas DNS daudzums (nanogramos) tiek aprēķināts, izmantojot sekojošo formulu:

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

Kur:

• ng of vector = vektora DNS daudzums, ko izmanto reakcijā (parasti 50-100 ng)
• kb size of insert = ievietošanas DNS fragmenta garums kilobaitos (kb)
• kb size of vector = vektora DNS garums kilobaitos (kb)
• molar ratio = vēlamā attiecība starp ievietošanas molekulām un vektora molekulām (parasti 3:1 līdz 5:1)

Tilpuma aprēķini

Kad ir noteikts nepieciešamais ievietošanas DNS daudzums, tiek aprēķināti nepieciešamie tilpumi reakcijai:

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

Piemēra aprēķins

Paskatīsimies uz praktisku piemēru:

• Vektora koncentrācija: 50 ng/μL
• Vektora garums: 3000 bp (3 kb)
• Ievietošanas koncentrācija: 25 ng/μL
• Ievietošanas garums: 1000 bp (1 kb)
• Vēlamā molārā attiecība (ievietojums:vektors): 3:1
• Kopējais reakcijas tilpums: 20 μL
• Vektora daudzums, ko izmantot: 50 ng

1. solis: Aprēķināt nepieciešamo ievietošanas daudzumu $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

2. solis: Aprēķināt tilpumus $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Šis aprēķins nodrošina, ka reakcijā ir trīs ievietošanas molekulas uz katru vektora molekulu, optimizējot veiksmīgas ligācijas iespējas.

Soli pa solim ceļvedis, kā izmantot kalkulatoru

Mūsu DNS ligācijas kalkulators ir izstrādāts, lai būtu intuitīvs un vienkāršs. Izpildiet šos soļus, lai aprēķinātu optimālos tilpumus jūsu ligācijas reakcijai:

1. Ievadiet vektora informāciju:

   • Ievadiet vektora koncentrāciju ng/μL
   • Ievadiet vektora garumu bāzu pāros (bp)
   • Norādiet vektora DNS daudzumu, ko vēlaties izmantot reakcijā (ng)

2. Ievadiet ievietošanas informāciju:

   • Ievadiet ievietošanas koncentrāciju ng/μL
   • Ievadiet ievietošanas garumu bāzu pāros (bp)

3. Iestatiet reakcijas parametrus:

   • Norādiet vēlamo molāro attiecību (ievietojums:vektors) - parasti no 3:1 līdz 5:1
   • Ievadiet kopējo reakcijas tilpumu μL (parasti 10-20 μL)

4. Skatiet rezultātus:

   • Kalkulators automātiski parādīs:
     • Nepieciešamo vektora tilpumu (μL)
     • Nepieciešamo ievietošanas tilpumu (μL)
     • Tilpumu, ko pievienot buferī/ūdenī (μL)
     • Kopējo reakcijas tilpumu (μL)
     • Vektora un ievietošanas DNS daudzumu reakcijā (ng)

5. Kopējiet rezultātus (pēc izvēles):

   • Izmantojiet "Kopēt rezultātus" pogu, lai kopētu visus aprēķinus uz jūsu starpliktuvi, lai izmantotu laboratorijas piezīmēs vai protokolos

Kalkulators veic validācijas pārbaudes, lai nodrošinātu, ka visi ievadi ir pozitīvi skaitļi un ka kopējais tilpums ir pietiekams, lai nodrošinātu nepieciešamos DNS tilpumus. Ja tiek konstatētas kādas kļūdas, noderīgas kļūdu ziņas palīdzēs jums labot ievadus.

Lietošanas gadījumi

DNS ligācijas kalkulators ir vērtīgs daudzās molekulārās bioloģijas lietojumprogrammās:

Molekulārā klonēšana

Visizplatītākais lietojuma gadījums ir standarta molekulārā klonēšana, kur pētnieki ievieto gēnus vai DNS fragmentus plazmidu vektoros. Kalkulators nodrošina optimālus apstākļus:

• Subklonējot gēnus starp dažādiem ekspresijas vektoriem
• Izveidojot fuzijas proteīnus, pievienojot vairākus gēnu fragmentus
• Veidojot ziņotāju gēnu testus
• Izveidojot plazmidu bibliotēkas

Sintētiskā bioloģija

Sintētiskajā bioloģijā, kur bieži tiek apvienoti vairāki DNS fragmenti:

• Gibson Assembly reakcijas gūst labumu no precīzām ievietošanas:vektora attiecībām
• Golden Gate montāžas sistēmām nepieciešamas specifiskas DNS koncentrācijas
• BioBrick montāža standartizētiem ģenētiskiem elementiem
• Sintētisko ģenētisko shēmu izveide

Diagnostikas komplektu izstrāde

Izstrādājot molekulāros diagnostikas rīkus:

• Slimību specifisku ģenētisko marķieru klonēšana
• Pozitīvo kontroles plazmidu izveide
• Kalibrācijas standartu izstrāde qPCR

Proteīnu ekspresijas sistēmas

Pētniekiem, kas strādā pie proteīnu ražošanas:

• Ievietošanas:vektora attiecību optimizēšana augstas kopijas ekspresijas vektoriem
• Inducējamu ekspresijas sistēmu izveide
• Sekretējošo vektoru izveide proteīnu attīrīšanai

CRISPR-Cas9 lietojumi

Ģenoma rediģēšanas lietojumos:

• Klonējot vadības RNA CRISPR vektoros
• Izveidojot donora veidnes homoloģiskai virzienā labojumam
• Izveidojot vadības RNA bibliotēkas skrīningam

Sarežģītas ligācijas

Kalkulators ir īpaši vērtīgs sarežģītās ligācijas situācijās:

• Lielu ievietojumu klonēšana (>5 kb)
• Ļoti mazu fragmentu ievietošanas (<100 bp)
• Blunt-end ligācijas, kurām ir zemāka efektivitāte
• Daudzu fragmentu montāžas reakcijas

Alternatīvas

Lai gan mūsu DNS ligācijas kalkulators nodrošina precīzus aprēķinus tradicionālām ligācijas reakcijām, pastāv vairākas alternatīvas pieejas, lai pievienotu DNS fragmentus:

1. Gibson Assembly: Izmanto eksonukleāzi, polimerāzi un ligāzi vienā reakcijā, lai pievienotu pārklājošus DNS fragmentus. Nav nepieciešams tradicionāls ligācijas aprēķins, bet koncentrācijas attiecības joprojām ir svarīgas.

2. Golden Gate Assembly: Izmanto Type IIS ierobežojošos fermentus virziena, bez rēta montāžai vairākiem fragmentiem. Nepieciešamas ekvivalentas visu fragmentu koncentrācijas.

3. SLIC (Sekvences un ligācijas neatkarīgā klonēšana): Izmanto eksonukleāzi, lai izveidotu vienpusējās pārliekas, kas savienojas kopā. Parasti izmanto ekvivalentas fragmentu attiecijas.

4. In-Fusion klonēšana: Komerciāls sistēma, kas ļauj pievienot fragmentus ar 15 bp pārklāšanos. Izmanto specifisku attiecību, pamatojoties uz fragmentu izmēriem.

5. Gateway klonēšana: Izmanto vietēji specifisku rekombināciju, nevis ligāciju. Nepieciešami specifiski ievešanas un galamērķa vektori.

6. Empīriskā testēšana: Dažas laboratorijas dod priekšroku izveidot vairākas ligācijas reakcijas ar dažādām ievietošanas:vektora attiecībām (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) un noteikt, kura darbojas vislabāk viņu specifiskajiem konstruktiem.

7. Programmatūras kalkulatori: Komerciālas programmatūras paketes, piemēram, Vector NTI un SnapGene, ietver ligācijas kalkulatorus ar papildu funkcijām, piemēram, ierobežojošo vietu analīzi.

Vēsture

DNS ligācijas aprēķinu izstrāde ir paralēla molekulārās klonēšanas tehniku attīstībai, kas ir revolucionējusi molekulāro bioloģiju un biotehnoloģiju.

Agrīnie attīstības posmi (1970. gadi)

DNS ligācijas koncepts molekulārās klonēšanas vajadzībām radās 1970. gados, kad Paul Berg, Herbert Boyer un Stanley Cohen izstrādāja pirmās rekombinantās DNS molekulas. Šajā periodā ligācijas reakcijas lielākoties bija empīriskas, pētnieki izmantoja izmēģinājumu un kļūdu, lai noteiktu optimālos apstākļus.

Ierobežojošo fermentu un DNS ligāzes atklāšana nodrošināja būtiskos rīkus, lai sagrieztu un atkal pievienotu DNS molekulas. T4 DNS ligāze, kas izolēta no T4 bakteriofāga inficētiem E. coli, kļuva par standarta enzīmu, lai pievienotu DNS fragmentus, pateicoties tās spējai ligēt gan blunt, gan kohezīvos galus.

Pilnveidošanas periods (1980. - 1990. gadi)

Kad molekulārā klonēšana kļuva par ikdienišķu praksi, pētnieki sāka izstrādāt sistemātiskākas pieejas ligācijas reakcijām. Bija acīmredzama molāro attiecību nozīme starp vektora un ievietošanas DNS, kas noveda pie pamata formulas izstrādes, ko joprojām izmanto šodien.

Šajā periodā pētnieki noteica, ka pārmērīgs ievietošanas DNS (parasti 3:1 līdz 5:1 molārā attiecība starp ievietojumu un vektoru) parasti uzlabo ligācijas efektivitāti standarta klonēšanas lietojumos. Šīs zināšanas sākotnēji tika dalītas laboratoriju protokolos un pakāpeniski nonāca molekulārās bioloģijas rokasgrāmatās un mācību grāmatās.

Mūsdienu laikmets (2000. gadi - pašreiz)

Datoru rīku un tiešsaistes kalkulatoru parādīšanās 2000. gados padarīja precīzus ligācijas aprēķinus pieejamākus pētniekiem. Kā molekulārās bioloģijas tehnikas kļuva sarežģītākas, precīzu aprēķinu nepieciešamība kļuva arvien kritiskāka, īpaši sarežģītiem klonēšanas projektiem, kuros iesaistīti vairāki fragmenti vai lieli ievietojumi.

Šodien DNS ligācijas aprēķini ir neatņemama molekulārās klonēšanas darba plūsmas sastāvdaļa, un veltīti kalkulatori, piemēram, šis, palīdz pētniekiem optimizēt savus eksperimentus. Pamata formula ir palikusi lielā mērā nemainīga, lai gan mūsu izpratne par faktoriem, kas ietekmē ligācijas efektivitāti, ir uzlabojusies.

Alternatīvo klonēšanas metožu, piemēram, Gibson Assembly un Golden Gate klonēšanas, parādīšanās ir ieviesusi jaunus aprēķinu vajadzības, taču pamata koncepts par molārajām attiecībām starp DNS fragmentiem paliek svarīgs visās šajās tehnikās.

Koda piemēri

Šeit ir DNS ligācijas kalkulatora īstenojumi dažādās programmēšanas valodās:

1' Excel VBA funkcija DNS ligācijas kalkulatoram
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Aprēķina nepieciešamo ievietošanas daudzumu ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Aprēķina vektora tilpumu μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Aprēķina ievietošanas tilpumu μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Aprēķina bufera/ūdens tilpumu μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Lietošanas piemērs šūnā:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Aprēķina tilpumus DNS ligācijas reakcijai.
5    
6    Parametri:
7    vector_concentration (float): Vektora DNS koncentrācija ng/μL
8    vector_length (float): Vektora DNS garums bāzu pāros
9    insert_concentration (float): Ievietošanas DNS koncentrācija ng/μL
10    insert_length (float): Ievietošanas DNS garums bāzu pāros
11    molar_ratio (float): Vēlamā molārā attiecība ievietojums:vektors
12    total_volume (float): Kopējais reakcijas tilpums μL
13    vector_amount (float): Vektora DNS daudzums, ko izmantot ng (noklusējums: 50)
14    
15    Atgriež:
16    dict: Vārdu krājums, kas satur aprēķinātos tilpumus un daudzumus
17    """
18    # Aprēķina vektora tilpumu
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Aprēķina nepieciešamo ievietošanas daudzumu
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Aprēķina ievietošanas tilpumu
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Aprēķina bufera/ūdens tilpumu
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Lietošanas piemērs
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektors: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Ievietojums: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buferis: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Kopā: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Pārvērš garumus kb aprēķinam
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Aprēķina nepieciešamo ievietošanas daudzumu
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Aprēķina tilpumus
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Lietošanas piemērs
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektors: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Ievietojums: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buferis: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Kopā: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Pārvērš garumus kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Aprēķina nepieciešamo ievietošanas daudzumu
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Aprēķina tilpumus
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Noapaļo līdz 2 decimāldaļām
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektors: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Ievietojums: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buferis: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Kopā: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Pārvērš garumus kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Aprēķina nepieciešamo ievietošanas daudzumu
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Aprēķina tilpumus
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Noapaļo līdz 2 decimāldaļām
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektors: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Ievietojums: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buferis: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Kopā: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Biežāk uzdotie jautājumi (BUJ)

Kāda ir optimālā molārā attiecība DNS ligācijai?

Optimālā ievietošanas un vektora molārā attiecība parasti svārstās no 3:1 līdz 5:1 standarta ligācijas lietojumiem. Tomēr tas var atšķirties atkarībā no konkrētās ligācijas situācijas:

• Blunt-end ligācijām: 3:1 līdz 5:1
• Kohezīvo galu ligācijām: 1:1 līdz 3:1
• Lieliem ievietojumiem (>10 kb): 1:1 līdz 2:1
• Mazām ievietojumiem (<500 bp): 5:1 līdz 10:1
• Daudzu fragmentu montāžai: 3:1 katram ievietojumam uz vektoru

Kāpēc mana ligācijas reakcija neizdodas, neskatoties uz to, ka izmantoju aprēķinātos tilpumus?

Daudzi faktori var ietekmēt ligācijas efektivitāti, kas pārsniedz molārās attiecības:

1. DNS kvalitāte: Pārliecinieties, ka gan vektors, gan ievietojums ir tīri gali bez bojājumiem
2. Defoforizācija: Pārbaudiet, vai jūsu vektors ir dephosphorylated, kas novērš pašligāciju
3. Enzīmu aktivitāte: Pārbaudiet, vai jūsu ligāze ir aktīva un izmantota pareizajā temperatūrā
4. Inkubācijas laiks: Dažām ligācijām labāk der ilgāks inkubācijas laiks (nakts laikā 16°C)
5. Bufera apstākļi: Pārliecinieties, ka tiek izmantots pareizs buferis ar ATP
6. Kontaminanti: Attīriet DNS, lai noņemtu inhibitorus, piemēram, EDTA vai augstu sāls saturu

Cik daudz vektora DNS man vajadzētu izmantot ligācijas reakcijā?

Parasti ieteicams izmantot 50-100 ng vektora DNS standarta ligācijas reakcijām. Pārāk daudz vektora var novest pie augsta fona negrieztā vai pašligētā vektora, bet pārāk maz var samazināt transformācijas efektivitāti. Sarežģītām ligācijām var būt nepieciešams optimizēt šo daudzumu.

Vai man jāpielāgo aprēķini blunt-end un sticky-end ligācijām?

Jā. Blunt-end ligācijas parasti ir mazāk efektīvas nekā sticky-end (kohezīvo galu) ligācijas. Blunt-end ligācijām izmantojiet:

• Augstākas molārās attiecijas (3:1 līdz 5:1 vai pat augstāk)
• Vairāk T4 DNS ligāzes (parasti 2-3 reizes vairāk)
• Garākas inkubācijas laika
• Apsveriet PEG pievienošanu, lai uzlabotu ligācijas efektivitāti

Kā es varu aprēķināt ligāciju vairākiem ievietojumiem?

Vairāku fragmentu montāžai:

1. Aprēķiniet katra ievietojuma daudzumu individuāli, izmantojot to pašu formulu
2. Uzturiet to pašu kopējo molāro attiecību (piemēram, diviem ievietojumiem izmantojiet 1.5:1.5:1 ievietojums1:ievietojums2:vektors)
3. Pielāgojiet kopējo reakcijas tilpumu, lai iekļautu visus DNS fragmentus
4. Apsveriet secīgu ligāciju vai izmantojiet montāžas metodes, piemēram, Gibson Assembly vairākiem fragmentiem

Vai es varu izmantot šo kalkulatoru Gibson Assembly vai Golden Gate Assembly?

Šis kalkulators ir īpaši izstrādāts tradicionālām ierobežojošo enzīmu un ligāzes bāzētām klonēšanas reakcijām. Gibson Assembly gadījumā parasti ieteicams izmantot ekvivalentas visu fragmentu koncentrācijas (1:1 attiecība), lai gan pamata DNS daudzuma aprēķins, pamatojoties uz garumu, ir līdzīgs. Golden Gate Assembly gadījumā arī parasti tiek izmantotas ekvivalentas visu komponentu koncentrācijas.

Kā es varu ņemt vērā vektora dephosphorylation savos aprēķinos?

Vektora dephosphorylation (5' fosfātu grupu noņemšana) novērš pašligāciju, taču nemaina daudzumu aprēķinus. Tomēr dephosphorylated vektoriem:

1. Izmantojiet svaigus ievietošanas DNS paraugus ar neskartiem 5' fosfātiem
2. Apsveriet iespēju izmantot nedaudz augstākas ievietošanas:vektora attiecības (4:1 līdz 6:1)
3. Pārliecinieties, ka ligācijas laiks ir ilgāks (vismaz 1 stunda istabas temperatūrā vai nakts laikā 16°C)

Kāds ir minimālais kopējais reakcijas tilpums, ko man vajadzētu izmantot?

Minimālais praktiskais reakcijas tilpums parasti ir 10 μL, kas ļauj nodrošināt pietiekamu sajaukšanu un novērst iztvaikošanas problēmas. Ja jūsu aprēķinātie DNS tilpumi pārsniedz vēlamo reakcijas tilpumu, jums ir vairākas iespējas:

1. Izmantojiet koncentrētākus DNS paraugus
2. Samaziniet izmantotā vektora daudzumu (piemēram, 25 ng vietā 50 ng)
3. Palieliniet kopējo reakcijas tilpumu
4. Apsveriet iespēju koncentrēt savus DNS paraugus

Cik ilgi man vajadzētu inkubēt savu ligācijas reakciju?

Optimālie inkubācijas laiki atšķiras atkarībā no ligācijas veida:

• Sticky-end ligācijām: 1 stunda istabas temperatūrā (22-25°C) vai 4-16 stundas 16°C
• Blunt-end ligācijām: 2-4 stundas istabas temperatūrā vai nakts laikā (12-16 stundas) 16°C
• Ātras ligācijas (izmantojot augstas koncentrācijas ligāzi): 5-15 minūtes istabas temperatūrā

Vai es varu izmantot atlikušās ligācijas reakcijas transformācijai?

Jā, ligācijas maisījumi parasti var tikt uzglabāti -20°C un atkārtoti izmantoti transformācijai. Tomēr katra sasalšanas-atkausēšanas cikla laikā var samazināties efektivitāte. Lai iegūtu labākus rezultātus:

1. Izveidojiet ligācijas maisījumu pirms sasalšanas
2. Siltuma inaktivējiet ligāzi (65°C 10 minūtes) pirms uzglabāšanas
3. Izmantojiet 1-2 mēnešu laikā, lai nodrošinātu optimālus rezultātus

Atsauces

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNS ligācijas protokols. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molekulārās klonēšanas tehniskais atsauce. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Klonēšanas tehniskais rokasgrāmata. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/