Kalibrācijas līknes kalkulators | Lineārā regresija laboratorijas analīzēm

Kas ir kalibrēšanas līknes kalkulators

Kalibrēšanas līknes kalkulators pārveido instrumenta rādījumus koncentrācijās. Tas izdara, pielāgojot taisni datu punktiem, kas iegūti no standartiem ar zināmu koncentrāciju, un pēc tam izmantojot šo taisni, lai jaunu rādījumu pārvērstu koncentrācijā. Laboratorijās kalibrēšanas līknes izmanto ķīmijā, bioloģijā un vides testēšanā, kad instruments tieši koncentrācijas vietā uzrāda signālu, piemēram, optisko blīvumu vai pīķa laukumu.

Šajā lapā kalkulators pielāgo taisni, izmantojot lineāro regresiju jeb mazāko kvadrātu metodi. Tas parāda slīpumu, brīvo locekli un R² — rādītāju, kas parāda, cik cieši punkti atbilst taisnei. Pēc tam tas var aprēķināt nezināma parauga koncentrāciju pēc izmērītā signāla.

Kalibrēšanas līknes formula

Kalibrēšanas līkne pieņem lineāru sakarību starp koncentrāciju un instrumenta signālu:

$y = mx + b$

• $y$ ir signāls (tas, ko mēra instruments)
• $x$ ir koncentrācija
• $m$ ir slīpums
• $b$ ir brīvais loceklis uz y ass

Kā aprēķināt slīpumu un brīvo locekli

Punktu kopai, kurā ir $n$ punkti, slīpums un brīvais loceklis, kas vislabāk atbilst datiem (pēc mazāko kvadrātu metodes), ir:

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

Šeit $\bar{x}$ un $\bar{y}$ ir visu punktu vidējā koncentrācija un vidējais signāls.

R² formula

R² jeb determinācijas koeficients parāda, cik labi taisne atbilst datiem:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ ir signāls, ko taisne prognozē katram $x_i$. R² vērtības ir diapazonā no 0 līdz 1. Vērtība 1 nozīmē, ka katrs punkts atrodas tieši uz taisnes.

Nezināmas koncentrācijas formula

Kad slīpums un brīvais loceklis ir zināmi, izmērīto signālu $y$ var pārveidot atpakaļ koncentrācijā:

$x = \frac{y - b}{m}$

Ja šis aprēķins dod negatīvu skaitli, kalkulators norāda koncentrāciju kā 0, jo negatīvai koncentrācijai nav fizikālas nozīmes. Tas norāda arī 0, ja pielāgotais slīpums ir 0, jo horizontāla taisne nesniedz informāciju par koncentrāciju.

Aprēķina piemērs

Pieņemsim, ka četri standarti dod šādus rezultātus:

Vidējā koncentrācija ir 3, bet vidējais signāls ir 0,20.

Slīpums:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

Brīvais loceklis:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

R²: salīdzinot prognozētos signālus ar faktiskajiem, iegūst R² = 0,9966.

Pielāgotā taisne ir:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

Tagad pieņemsim, ka nezināms paraugs dod signālu 0,20. Tā koncentrācija ir:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

Kā izmantot šo kalkulatoru

1. Ievadiet katra standarta zināmo koncentrāciju un izmērīto signālu kā divu skaitļu pāri. Kalkulators sākumā parāda divas rindas.
2. Izvēlieties “Pievienot datu punktu”, lai ievadītu vairāk standartu, vai blakus rindai izvēlieties “Noņemt datu punktu”, lai to dzēstu. Nepieciešami vismaz divi punkti.
3. Kad ir aizpildīti vismaz divi punkti, kalkulators parāda regresijas vienādojumu, R² vērtību un punktu grafiku ar pielāgoto taisni. Slīpums, brīvais loceklis, R² un koncentrācija tiek noapaļoti līdz četrām zīmēm aiz komata.
4. Sadaļā “Aprēķināt nezināmo koncentrāciju” ievadiet izmērīto signālu, lai redzētu atbilstošo koncentrāciju. Tā tiek atjaunināta automātiski, rakstot vērtību; nav jāspiež atsevišķa poga.
5. Izvēlieties “Atiestatīt”, lai notīrītu visus ievadītos punktus un signāla lauku un sāktu no jauna.

Slīpuma, brīvā locekļa un R² interpretācija

Slīpums parāda, par cik mainās signāls uz vienu koncentrācijas vienību. Lielāks slīpums nozīmē, ka metode spēcīgi reaģē uz nelielām koncentrācijas izmaiņām.

Brīvais loceklis ir prognozētais signāls pie nulles koncentrācijas. Tas atspoguļo fona signālu, piemēram, tukša parauga vai instrumenta sākumstāvokļa signālu. Nenulles brīvais loceklis ir izplatīts un pats par sevi nav problēma, taču liels vai starp kalibrēšanām nestabils brīvais loceklis var liecināt par piesārņojumu vai instrumenta darbības traucējumiem.

R² parāda, cik cieši punkti atbilst taisnei. Vērtības virs 0,99 ir raksturīgas labi funkcionējošai lineārai metodei. Zemāks R² var liecināt par pipetēšanas kļūdu, degradējušos standartu vai koncentrācijas diapazonu, kurā signāls vairs nav lineārs.

Kur izmanto kalibrēšanas līknes

Kalibrēšanas līknes ir izplatītas visur, kur instrumenta neapstrādātais signāls jāpārvērš koncentrācijā:

• Spektrofotometrija — izmēra gaismas absorbanci un pārveido to koncentrācijā, piemēram, nosakot olbaltumvielu vai pigmentu saturu.
• Hromatogrāfija (HPLC, GC) — hromatogrāfiskā pīķa laukumu vai augstumu pārveido koncentrācijā; to bieži izmanto zāļu pārbaudēs un vides analīzē.
• ELISA un citi imūnanalīžu veidi — no mikroplašu lasītāja iegūto krāsas vai fluorescences intensitāti pārveido antigēna vai antivielas koncentrācijā.
• qPCR — cikla sliekšņa vērtības no zināma parauga sērijveida atšķaidījumiem veido līkni, ko izmanto ģenētiskā materiāla daudzuma noteikšanai nezināmā paraugā.

Kad taisne neatbilst datiem

Dažas metodes visā diapazonā nav lineāras. Bieži risinājumi ir ierobežot kalibrēšanu līdz šaurākam lineāram reģionam, pirms taisnes pielāgošanas izmantot logaritmisku pārveidošanu, izmantot polinomiālu (liektu) modeli vai izmantot svērto regresiju, ja mērījuma kļūda, palielinoties koncentrācijai, pieaug vai samazinās. Šis kalkulators pielāgo tikai taisni; ja punkti ir skaidri izliekti, rezultāti būs mazāk uzticami un var būt vajadzīgs cits modelis.

Biežāk uzdotie jautājumi

Kas ir kalibrēšanas līkne?

Kalibrēšanas līkne ir taisne, kas pielāgota instrumenta rādījumiem paraugiem ar zināmu koncentrāciju. To izmanto, lai jaunu rādījumu no parauga ar nezināmu koncentrāciju pārvērstu koncentrācijas vērtībā.

Cik datu punktu nepieciešams kalibrēšanas līknei?

Lai pielāgotu taisni, kalkulatoram nepieciešami vismaz divi punkti, taču divi punkti nevar parādīt, vai faktiskā sakarība patiešām ir lineāra. Lielākā daļa laboratoriju izmanto piecus līdz astoņus standartus, kas aptver paredzamo nezināmo paraugu diapazonu.

Ko R² nozīmē kalibrēšanas līknē?

R² mēra, cik cieši datu punkti atbilst pielāgotajai taisnei skalā no 0 līdz 1. Vērtība 1 nozīmē, ka katrs punkts atrodas tieši uz taisnes. Vērtības virs 0,99 parasti uzskata par spēcīgu lineāras sakarības pierādījumu.

Vai koncentrāciju var aprēķināt ārpus standartu diapazona?

Koncentrācijas aprēķināšana zemāk par zemāko standartu vai augstāk par augstāko standartu nav uzticama, jo nav datu, kas apstiprinātu, ka taisne tur saglabājas lineāra. Labāk ir atšķaidīt paraugu, kura rādījums ir pārāk augsts, vai koncentrēt paraugu, kura rādījums ir pārāk zems, un atkārtot mērījumu kalibrētajā diapazonā.

Kāpēc aprēķinātā koncentrācija dažkārt tiek parādīta kā 0?

Ja izmērītais signāls ir zemāks par pielāgoto brīvo locekli (pie pozitīva slīpuma), formula $x = (y - b) / m$ dod negatīvu skaitli. Šādā gadījumā kalkulators parāda 0, jo reāla koncentrācija nevar būt negatīva. Tas parāda arī 0, ja slīpums ir 0, kas notiek, ja visiem standartiem ir vienāds signāls vai vienāda koncentrācija.

Kāda ir atšķirība starp slīpumu un brīvo locekli?

Slīpums raksturo signāla jutību pret koncentrācijas izmaiņām. Brīvais loceklis ir pie nulles koncentrācijas prognozētais signāls, kas bieži atspoguļo fona signālu, nevis pašu analizējamo vielu.