Bereken nauwkeurige monster volumes op basis van BCA-assay absorbantiewaarden en gewenste proteïne massa. Essentieel voor consistente proteïnebelasting in western blots en andere laboratoriumtoepassingen.
Dit hulpmiddel berekent het vereiste monstervolume op basis van BCA absorbantieresultaten en monstergewicht. Voer de absorbentiewaarde en het monstergewicht voor elk monster in om het bijbehorende monstervolume te berekenen.
Het monstervolume wordt berekend met behulp van de volgende formule:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
De BCA Absorbent Monster Volume Calculator is een gespecialiseerd hulpmiddel dat is ontworpen om onderzoekers en laboratoriumtechnici te helpen bij het nauwkeurig bepalen van het juiste monstervolume voor experimenten op basis van BCA (bicinchoninezuur) assayresultaten. Deze calculator neemt de absorptielezingen van uw BCA-assay en uw gewenste monstergewicht om het precieze volume te berekenen dat nodig is voor consistente eiwitbelasting in toepassingen zoals western blotting, enzymatische assays en andere eiwitanalysetechnieken.
De BCA-assay is een van de meest gebruikte methoden voor eiwitkwantificatie in biochemie- en moleculaire biologie-laboratoria. Door de absorptie van uw eiwitmonsters te meten en deze te vergelijken met een standaardcurve, kunt u de eiwitconcentratie met hoge nauwkeurigheid bepalen. Onze calculator stroomlijnt dit proces door absorptielezingen automatisch om te zetten in de exacte monstervolumes die nodig zijn voor uw experimenten.
De Bicinchoninezuur (BCA) assay is een biochemische assay voor het bepalen van de totale concentratie van eiwit in een oplossing. Het principe van deze assay is gebaseerd op de vorming van een Cu²⁺-eiwitcomplex onder alkalische omstandigheden, gevolgd door de reductie van Cu²⁺ naar Cu¹⁺. De hoeveelheid reductie is evenredig met het aanwezige eiwit. BCA vormt een paarse gekleurde complex met Cu¹⁺ in alkalische omgevingen, wat een basis biedt om de reductie van koper door eiwitten te monitoren.
De intensiteit van de paarse kleur neemt evenredig toe met de eiwitconcentratie, die kan worden gemeten met een spectrofotometer op ongeveer 562 nm. De absorptielezingen worden vervolgens vergeleken met een standaardcurve om de eiwitconcentratie in onbekende monsters te bepalen.
De fundamentele formule voor het berekenen van het monstervolume op basis van BCA absorptieresultaten is:
Waarbij:
De eiwitconcentratie wordt berekend uit de absorptielezing met behulp van de vergelijking van de standaardcurve:
Voor een standaard BCA-assay is de typische helling ongeveer 2.0, en de interceptie is vaak dicht bij nul, hoewel deze waarden kunnen variëren op basis van uw specifieke assayomstandigheden en standaardcurve.
Onze calculator vereenvoudigt het proces van het bepalen van monstervolumes op basis van BCA-assayresultaten. Volg deze stappen om nauwkeurige berekeningen te krijgen:
Voer Monsterinformatie in:
Selecteer het type standaardcurve:
Bekijk de resultaten:
Kopieer of exporteer resultaten:
Laten we een praktisch voorbeeld doornemen:
Dit betekent dat u 13.33 μL van uw monster moet laden om 20 μg eiwit te verkrijgen.
De calculator biedt verschillende belangrijke informatie:
Eiwitconcentratie: Dit wordt berekend uit uw absorptielezing met behulp van de geselecteerde standaardcurve. Het vertegenwoordigt de hoeveelheid eiwit per eenheid volume in uw monster (μg/μL).
Monster Volume: Dit is het volume van uw monster dat de gewenste hoeveelheid eiwit bevat. Deze waarde is wat u zult gebruiken bij het voorbereiden van uw experimenten.
Waarschuwingen en Aanbevelingen: De calculator kan waarschuwingen geven voor:
Een van de meest voorkomende toepassingen voor deze calculator is het voorbereiden van monsters voor western blotting. Consistente eiwitbelasting is cruciaal voor betrouwbare western blotresultaten, en deze calculator zorgt ervoor dat u dezelfde hoeveelheid eiwit voor elk monster laadt, zelfs wanneer hun concentraties verschillen.
Voorbeeldworkflow:
Voor enzymatische assays is het vaak noodzakelijk om een specifieke hoeveelheid eiwit te gebruiken om de reactieve omstandigheden tussen verschillende monsters of experimenten te standaardiseren.
Voorbeeldworkflow:
In immunoprecipitatie-experimenten is het belangrijk om te beginnen met een consistente hoeveelheid eiwit om resultaten tussen verschillende omstandigheden te vergelijken.
Voorbeeldworkflow:
Tijdens eiwitzuivering is het vaak noodzakelijk om de eiwitconcentratie en totale eiwithoeveelheden bij verschillende stappen bij te houden.
Voorbeeldworkflow:
Hoewel de calculator standaardparameters voor standaard BCA-assays biedt, kunt u ook aangepaste waarden invoeren als u uw eigen standaardcurve hebt gegenereerd. Dit is bijzonder nuttig wanneer:
Om een aangepaste standaardcurve te gebruiken:
De calculator stelt u in staat om meerdere monsters toe te voegen en hun volumes gelijktijdig te berekenen. Dit is vooral nuttig wanneer u monsters voorbereidt voor experimenten die consistente eiwitbelasting over meerdere omstandigheden vereisen.
Voordelen van batchverwerking:
Als uw absorptielezing boven de 2.0 ligt, kan deze buiten het lineaire bereik van de BCA-assay liggen. In dergelijke gevallen:
Voor absorptielezingen onder de 0.1, kunt u dicht bij de detectielimiet van de assay zijn, wat de nauwkeurigheid kan beïnvloeden. Overweeg:
Als de calculator een volume suggereert dat te groot is voor uw toepassing:
De nauwkeurige kwantificatie van eiwitten is een fundamentele vereiste in biochemie en moleculaire biologie sinds deze velden zijn ontstaan. Vroege methoden waren gebaseerd op de bepaling van het stikstofgehalte, wat tijdrovend was en gespecialiseerde apparatuur vereiste.
Kjeldahl Methode (1883): Een van de vroegste methoden voor eiwitkwantificatie, gebaseerd op het meten van stikstofgehalte.
Biuret Test (Begin 1900): Deze methode is gebaseerd op de reactie tussen peptidebindingen en koperionen in een alkalische oplossing, wat een violetkleurige kleur produceert.
Lowry Assay (1951): Ontwikkeld door Oliver Lowry, deze methode combineerde de Biuret-reactie met het Folin-Ciocalteu-reagens, wat de gevoeligheid verhoogde.
Bradford Assay (1976): Marion Bradford ontwikkelde deze methode met behulp van Coomassie Brilliant Blue G-250-dye, die aan eiwitten bindt en de absorptiemaximum verschuift.
BCA Assay (1985): Ontwikkeld door Paul Smith en collega's van Pierce Chemical Company, deze methode combineerde de biuretreactie met BCA-detectie, wat verbeterde gevoeligheid en compatibiliteit met detergenten bood.
De BCA-assay werd voor het eerst beschreven in een artikel uit 1985 door Smith et al. getiteld "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Het werd ontwikkeld om de beperkingen van bestaande methoden aan te pakken, vooral de interferentie van verschillende chemicaliën die vaak worden gebruikt in eiwitextractie en -zuivering.
De belangrijkste innovatie was het gebruik van bicinchoninezuur om de Cu¹⁺-ionen te detecteren die worden geproduceerd door eiwitgemedieerde reductie van Cu²⁺, wat een paarse gekleurde complex vormt dat spectrofotometrisch kan worden gemeten. Dit bood verschillende voordelen:
Sinds de introductie is de BCA-assay een van de meest gebruikte methoden voor eiwitkwantificatie in biochemie- en moleculaire biologie-laboratoria over de hele wereld geworden.
1=IF(B2<=0,"Fout: Ongeldige absorptie",IF(C2<=0,"Fout: Ongeldig monstergewicht",C2/(2*B2)))
2
3' Waar:
4' B2 bevat de absorptielezing
5' C2 bevat het gewenste monstergewicht in μg
6' De formule retourneert het vereiste monstervolume in μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Bereken eiwitconcentratie uit absorptie met behulp van standaardcurve."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorptie kan niet negatief zijn")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Bereken vereist monstervolume op basis van absorptie en gewenste massa."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Monstergewicht moet positief zijn")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Bereken de eiwitconcentratie moet positief zijn")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Voorbeeldgebruik
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Voor absorptie {absorbance} en gewenste eiwitmassa {sample_mass} μg:")
31 print(f"Eiwitconcentratie: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Vereist monstervolume: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Fout: {e}")
351# Functie om eiwitconcentratie uit absorptie te berekenen
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorptie kan niet negatief zijn")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Functie om monstervolume te berekenen
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Monstergewicht moet positief zijn")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Bereken de eiwitconcentratie moet positief zijn")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Voorbeeldgebruik
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Voor absorptie %.2f en gewenste eiwitmassa %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Eiwitconcentratie: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Vereist monstervolume: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Fout: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorptie kan niet negatief zijn");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Monstergewicht moet positief zijn");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Bereken de eiwitconcentratie moet positief zijn");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Voorbeeldgebruik
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Voor absorptie ${absorbance} en gewenste eiwitmassa ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Eiwitconcentratie: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Vereist monstervolume: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Fout: ${error.message}`);
37}
38De relatie tussen absorptie en eiwitconcentratie is doorgaans lineair binnen een bepaald bereik. Hieronder staat een visualisatie van een standaard BCA-curve:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Verschillende eiwitkwantificatiemethoden hebben verschillende voordelen en beperkingen. Hier is hoe de BCA-assay zich verhoudt tot andere veelgebruikte methoden:
| Methode | Gevoeligheidsbereik | Voordelen | Beperkingen | Het beste voor |
|---|---|---|---|---|
| BCA Assay | 5-2000 μg/mL | • Compatibel met detergenten • Minder eiwit-tot-eiwitvariatie • Stabiele kleurontwikkeling | • Gehinderd door reducerende middelen • Beïnvloed door sommige chelerende middelen | • Algemene eiwitkwantificatie • Monsters die detergenten bevatten |
| Bradford Assay | 1-1500 μg/mL | • Snel (2-5 min) • Weinig interfererende stoffen | • Hoge eiwit-tot-eiwitvariatie • Incompatibel met detergenten | • Snelle metingen • Detergent-vrije monsters |
| Lowry Methode | 1-1500 μg/mL | • Goed gevestigde methode • Goede gevoeligheid | • Veel interfererende stoffen • Meerdere stappen | • Historische consistentie • Pure eiwitmonsters |
| UV Absorptie (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Niet-destructief • Zeer snel • Geen reagentia nodig | • Beïnvloed door nucleïnezuren • Vereist pure monsters | • Pure eiwitoplossingen • Snelle controles tijdens zuivering |
| Fluorometrisch | 0.1-500 μg/mL | • Hoogste gevoeligheid • Brede dynamische range | • Duur reagentia • Vereist fluorometer | • Zeer verdunde monsters • Beperkt monstervolume |
De BCA (bicinchoninezuur) assay wordt voornamelijk gebruikt voor het kwantificeren van de totale eiwitconcentratie in een monster. Het wordt veel gebruikt in biochemie, cellulaire biologie en moleculaire biologie voor toepassingen zoals western blotting, enzymassays, immunoprecipitatie en eiwitzuivering.
De BCA-assay is over het algemeen nauwkeurig binnen 5-10% wanneer deze correct wordt uitgevoerd. De nauwkeurigheid hangt af van verschillende factoren, waaronder de kwaliteit van de standaardcurve, de afwezigheid van interfererende stoffen en of de samenstelling van het onbekende eiwit vergelijkbaar is met het standaard eiwit dat wordt gebruikt.
Verschillende stoffen kunnen de resultaten van de BCA-assay beïnvloeden, waaronder:
De belangrijkste verschillen zijn:
Als uw calculator een zeer groot monstervolume toont, geeft dit meestal een lage eiwitconcentratie in uw monster aan. Dit kan het gevolg zijn van:
Overweeg uw monster te concentreren of uw experimentele ontwerp aan te passen om de lagere eiwitconcentratie te accommoderen.
Deze calculator is specifiek ontworpen voor BCA-assayresultaten. Hoewel het basisprincipe (omzetten van concentratie naar volume) ook van toepassing is op andere methoden, varieert de relatie tussen absorptie en eiwitconcentratie tussen verschillende assays. Voor andere methoden zoals Bradford of Lowry moet u verschillende standaardcurveparameters gebruiken.
Voor absorptielezingen buiten het lineaire bereik (typisch >2.0):
Boviene serumalbumine (BSA) is het meest gebruikte standaard voor BCA-assays omdat het:
Als uw monsters echter een overwegend eiwit bevatten dat aanzienlijk verschilt van BSA, overweeg dan om dat eiwit als uw standaard te gebruiken voor nauwkeurigere resultaten.
De paarse kleur die in de BCA-reactie wordt ontwikkeld, is enkele uren bij kamertemperatuur stabiel en kan op elk moment binnen die periode worden gemeten. Voor de beste resultaten wordt echter aanbevolen om alle standaarden en monsters op ongeveer hetzelfde moment na kleurontwikkeling te meten.
Hoewel het technisch mogelijk is om een standaardcurve te hergebruiken, wordt het niet aanbevolen voor nauwkeurige kwantificatie. Variaties in reagentia, incubatieomstandigheden en instrumentkalibratie kunnen de relatie tussen absorptie en eiwitconcentratie beïnvloeden. Voor betrouwbare resultaten, genereer elke keer dat u de assay uitvoert een nieuwe standaardcurve.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instructies. Beschikbaar op: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Nu u de principes achter BCA-eiwitkwantificatie en monstervolume berekening begrijpt, probeer onze calculator om uw laboratoriumworkflow te stroomlijnen. Voer eenvoudig uw absorptielezingen en gewenste monstergewicht in om directe, nauwkeurige monstervolume berekeningen te krijgen.
Of u nu monsters voorbereidt voor western blotting, enzymatische assays of andere eiwitgebaseerde experimenten, onze calculator helpt ervoor te zorgen dat u consistente en betrouwbare resultaten krijgt. Bespaar tijd, verminder fouten en verbeter de reproduceerbaarheid van uw experimenten met de BCA Absorbent Monster Volume Calculator.
Ontdek meer tools die handig kunnen zijn voor uw workflow