BCA Monstervolume Calculator | Proteïne Kwantificatie Tool

Wat is een calculator voor het BCA-monstervolume

Een calculator voor het BCA-monstervolume zet een absorbantiewaarde uit een BCA-eiwitassay om in het monstervolume, in microliter (μL), dat nodig is om een bepaalde hoeveelheid eiwit op te brengen. De calculator wordt gebruikt na een bicinchoninezuur-(BCA-)eiwitassay, een veelgebruikte laboratoriumtest die meet hoeveel eiwit zich in een oplossing bevindt door te bepalen hoeveel paars lichtabsorberend kleur het monster ontwikkelt.

Hoe de BCA-assay eiwit meet

De BCA-assay werkt in twee stappen. Eerst reduceert eiwit in het monster koperionen (Cu²⁺) tot een andere vorm (Cu¹⁺) in een alkalische oplossing. De mate van reductie hangt af van de hoeveelheid aanwezig eiwit. Vervolgens bindt bicinchoninezuur het gereduceerde koper en vormt het een paarse verbinding die sterk licht absorbeert bij een golflengte van 562 nanometer (nm).

Een spectrofotometer meet hoeveel licht het monster bij 562 nm absorbeert. Dat getal heet de absorbantie. Een donkerdere paarse kleur betekent een hogere absorbantie en meer eiwit. Een laboratorium vergelijkt de absorbantie van elk monster met een standaardcurve, die wordt opgesteld door bekende concentraties van een referentie-eiwit te meten, meestal runderserumalbumine (BSA).

BCA is populair omdat de methode blijft werken wanneer een monster detergenten zoals SDS of Triton X-100 bevat, stoffen die veel voorkomen in buffers voor cellyse maar de twee oudere assays, de Bradford- en Lowry-methode, verstoren.

Formule voor de omzetting van BCA-absorbantie naar monstervolume

Een BCA-standaardcurve is een rechte lijn die wordt gefit op absorbantie als functie van concentratie:

$\text{Absorbantie} = \text{Helling} \times \text{Concentratie} + \text{Intercept}$

Omgekeerd, van een gemeten absorbantie terug naar de eiwitconcentratie, wordt de vergelijking omgekeerd:

$\text{Eiwitconcentratie (μg/μL)} = \frac{\text{Absorbantie} - \text{Intercept}}{\text{Helling}}$

Zodra de concentratie bekend is, wordt het monstervolume dat een bepaalde eiwitmassa bevat als volgt berekend:

$\text{Monstervolume (μL)} = \frac{\text{Monstermassa (μg)}}{\text{Eiwitconcentratie (μg/μL)}}$

De calculator biedt vier vooraf ingestelde curvetypen, elk met een eigen helling en intercept. Het intercept bedraagt 0 voor elke voorinstelling, omdat de metingen zijn gecorrigeerd voor de blanco (de absorbantie van een eiwitvrije controle wordt eerst afgetrokken). De helling geeft weer welk deel van het absorbantiebereik van de plaat het werkbereik van elk protocol beslaat.

Een gevoeliger protocol, dat is ontwikkeld voor verdunde monsters, produceert meer absorbantie per microgram eiwit en heeft daarom een grotere helling. Enhanced BCA en Micro-BCA zijn bedoeld voor monsters die te verdund zijn om met het standaardprotocol nauwkeurig te worden gemeten.

Zo berekent u het monstervolume uit BCA-absorbantie

1. Voer de BCA-assay uit en meet voor elk monster de absorbantie bij 562 nm.
2. Kies het curvetype dat overeenkomt met het gebruikte protocol (Standard, Enhanced of Micro), of voer een aangepaste helling en snijpunt in van een curve die die dag is opgesteld.
3. Voer voor elk monster de absorbantiewaarde en de gewenste eiwitmassa, in microgram, in.
4. De calculator zet absorbantie om in eiwitconcentratie en deelt vervolgens de gewenste massa door die concentratie om het te pipetteren volume te berekenen.

Voorbeeld: monstervolume berekenen uit BCA-absorbantie

Een onderzoeker die een western blot voorbereidt, heeft 20 μg eiwit per baan nodig en gebruikt de standaard-BCA-curve (helling 1,0, snijpunt 0).

Monster A heeft een absorbantie van 0,75:

• Eiwitconcentratie = (0,75 − 0) / 1,0 = 0,75 μg/μL
• Monstervolume = 20 μg ÷ 0,75 μg/μL = 26,67 μL

Monster B heeft een absorbantie van 1,2:

• Eiwitconcentratie = (1,2 − 0) / 1,0 = 1,2 μg/μL
• Monstervolume = 20 μg ÷ 1,2 μg/μL = 16,67 μL

Monster A is meer verdund en er is dus een groter volume nodig om dezelfde gewenste hoeveelheid van 20 μg te bereiken.

De resultaten van de calculator begrijpen

De calculator rapporteert voor elk monster twee getallen: de eiwitconcentratie, in μg/μL, en het monstervolume, in μL. Ook markeert de calculator resultaten die waarschijnlijk problemen veroorzaken:

• Een absorbantie boven 3,0 activeert een waarschuwing, omdat typische BCA-metingen tussen 0 en 2,0 liggen.
• Een absorbantie onder 0,05 (maar boven nul) activeert een waarschuwing dat het resultaat mogelijk minder nauwkeurig is, omdat een zwak signaal gevoeliger is voor meetruis.
• Een berekend volume van 1000 μL of meer activeert een waarschuwing om een meer geconcentreerd monster te gebruiken.
• Een berekend volume van minder dan 0,5 μL activeert een waarschuwing dat het volume mogelijk moeilijk nauwkeurig te pipetteren is.
• Negatieve absorbantie of een negatieve monstermassa wordt zonder meer afgewezen.

Praktische toepassingen in het laboratorium

Consistente eiwitbelading is een van de meest voorkomende oorzaken van problemen bij een western blot: een ongelijke bandintensiteit tussen de banen weerspiegelt vaak een ongelijke eiwitbelading en niet echte verschillen in expressie. Door voor elk monster op basis van de eigen absorbantiewaarde een exact volume te berekenen, blijft de belading over de hele gel consistent.

Dezelfde berekening geldt voor enzymassays, waarbij het vergelijken van activiteit tussen omstandigheden vereist dat wordt uitgegaan van gelijke totale hoeveelheden eiwit, en voor immunoprecipitatie, waarbij ongelijke hoeveelheden ingevoerd eiwit (bijvoorbeeld 800 μg in de ene buis tegenover 1200 μg in een andere) resultaten moeilijk vergelijkbaar maken. Tijdens eiwitzuivering wordt dezelfde formule bij elke stap gebruikt om bij te houden hoeveel eiwit in elke fractie overblijft.

Vergelijking met andere eiwitassays

Een korte geschiedenis van eiwitkwantificatie

Bij vroege eiwitmetingen werd gebruikgemaakt van de Kjeldahl-methode (1883), waarbij het stikstofgehalte werd gemeten nadat een monster in zuur was gedigereerd. De biureettest, ontwikkeld aan het begin van de jaren 1900, gebruikte een kleurreactie tussen peptidebindingen en koperionen, maar was niet erg gevoelig. Oliver Lowry combineerde de biureetreactie met een aanvullend reagens in 1951 en ontwikkelde zo de Lowry-methode, die tientallen jaren de eiwitmeting domineerde ondanks verstoring door veelgebruikte laboratoriumstoffen zoals detergenten en EDTA. Marion Bradford introduceerde in 1976 een snellere kleurstofbindingsmethode, maar ook deze methode werkte niet in aanwezigheid van detergenten en de uitkomst hing af van het aminozuurgehalte van het eiwit. Paul Smith en collega's van Pierce Chemical Company publiceerden in 1985 de BCA-methode. Deze combineert biureetchemie met de grotere gevoeligheid van bicinchoninezuur voor koper en levert een assay op die de detergenten in typische cellysaten verdraagt.

Codevoorbeeld

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

Veelgestelde vragen

Waarvoor wordt de BCA-assay gebruikt? De assay meet de totale eiwitconcentratie in een oplossing, meestal voordat gelijke hoeveelheden eiwit voor een western blot worden opgebracht, voordat enzymactiviteitsassays worden genormaliseerd of tijdens het volgen van de opbrengst bij eiwitzuivering.

Hoe nauwkeurig is de BCA-assay? Onder goede omstandigheden zijn de resultaten meestal nauwkeurig binnen 5–10%, op voorwaarde dat de standaardcurve ten minste vijf of zes punten bevat en het monster geen hoge concentratie van een storende stof bevat.

Wat verstoort de resultaten van de BCA-assay? Reducerende stoffen, waaronder DTT en β-mercaptoethanol, verhogen de absorbantie kunstmatig doordat ze onafhankelijk van eiwit zelf koper reduceren. Chelerende stoffen zoals EDTA verlagen de absorbantie doordat ze koper binden voordat dit kan reageren.

Wat is het verschil tussen BCA- en Bradford-assays? Bradford levert in ongeveer vijf minuten een resultaat op, maar wordt verstoord door detergenten en reageert verschillend afhankelijk van de aminozuursamenstelling van een eiwit. BCA duurt ongeveer 30 minuten, maar verdraagt detergenten en geeft consistentere metingen voor verschillende eiwitten, waardoor deze methode geschikter is voor cellysaten.

Waarom is een berekend monstervolume ongewoon groot? Een groot volume betekent dat de gemeten eiwitconcentratie lager is dan verwacht. Veelvoorkomende oorzaken zijn onvolledige cellyse, een te sterk verdund monster of een absorbantiemeting nabij de onderste detectiegrens van de assay. Het monster concentreren met behulp van een centrifugaalfilter of overschakelen op het Enhanced- of Micro-BCA-protocol verhelpt dit meestal.

Wat moet er worden gedaan als de absorbantie buiten het lineaire bereik valt? Verdun het monster en meet het opnieuw. De relatie tussen absorbantie en concentratie valt boven ongeveer 2,0 uiteen; extrapolatie voorbij de standaardcurve onderschat de werkelijke concentratie.

Referenties

1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85.
2. Thermo Fisher Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit" gebruikershandleiding (MAN0011430).
3. Bradford MM. "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein." Analytical Biochemistry. 1976;72(1-2):248-254.