Enzymaktivitetsberegner - Michaelis-Menten Kinetikk

Kalkulator for enzymaktivitet

En kalkulator for enzymaktivitet finner hvor raskt et enzym omdanner substrat til produkt, uttrykt som spesifikk aktivitet i enheter per milligram (U/mg). Den bruker Michaelis-Menten-ligningen, standardmodellen for enzymkinetikk, sammen med mengden enzymprotein i prøven.

Enzymer er proteiner som øker hastigheten på kjemiske reaksjoner i celler uten selv å bli brukt opp. Forskere måler hvor aktivt et enzym er for å sammenligne ulike batcher, kontrollere om et rensetrinn fungerte, eller undersøke hvordan et legemiddel påvirker enzymets hastighet. Et tall for enzymkonsentrasjonen alene sier ikke om enzymet fungerer som det skal. Det gjør spesifikk aktivitet.

Hva kalkulatoren beregner

Verktøyet bruker fem inndata: enzymkonsentrasjon, substratkonsentrasjon, Michaelis-konstanten (Km), maksimalhastigheten (Vmax) og reaksjonstid. Reaksjonstiden registreres som referanse, men inngår ikke i formelen. Vmax er allerede en hastighet, altså en mengde substrat omdannet per minutt, så tiden er allerede tatt med. Hvis man deler på tid en gang til, telles den to ganger.

Kalkulatoren gir ett tall og ett diagram:

• Spesifikk aktivitet, i U/mg. Dette er reaksjonshastigheten delt på mengden enzymprotein som er til stede.
• Et diagram over reaksjonshastighet mot substratkonsentrasjon, som viser de lave, overgangs- og mettede delene av kurven. Hastigheten ved den angitte substratkonsentrasjonen er markert i diagrammet.

Slik beregnes enzymaktivitet

Michaelis-Menten-ligningen

Leonor Michaelis og Maud Menten publiserte denne modellen i 1913. Den beskriver hvordan reaksjonshastigheten til et enzym avhenger av substratkonsentrasjonen:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = reaksjonshastighet, hastigheten ved en gitt substratkonsentrasjon
• $V_{max}$ = maksimalhastighet, hastigheten når enzymet er fullstendig mettet med substrat
• $[S]$ = substratkonsentrasjon
• $K_m$ = Michaelis-konstanten: substratkonsentrasjonen der hastigheten er halvparten av Vmax

Formel for spesifikk aktivitet

Spesifikk aktivitet deler denne hastigheten på mengden enzymprotein som er til stede, og gir et resultat i enheter per milligram (U/mg):

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Her er $A$ den spesifikke aktiviteten, og $[E]$ enzymkonsentrasjonen.

Én enzymenhet (U) er mengden enzym som omdanner 1 mikromol (µmol) substrat per minutt. Denne definisjonen er fastsatt av International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB).

Enhetene går opp på følgende måte. I Michaelis-Menten-ligningen har hastigheten enheten substratkonsentrasjon delt på tid. Kalkulatoren bruker [S] og Km i mM, så Vmax og v er i µmol per minutt per milliliter, skrevet µmol/(min·mL). Det er det samme som mM/min, og det samme som U/mL. Enzymkonsentrasjonen [E] er i mg/mL. Ved divisjon forkortes milliliterne bort:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax har allerede «per minutt» i enheten, så det skal ikke være et separat tidsledd i formelen.

Denne beregningen forutsetter at den målte hastigheten er en starthastighet, målt tidlig i reaksjonen før substratet begynner å bli mangelvare eller produktet begynner å hemme enzymet. Laboratorier måler vanligvis de første 5–10% av substratomdanningen for å holde seg i dette lineære området.

Regneeksempel

Eksempel 1. Enzymkonsentrasjon 1 mg/mL, substratkonsentrasjon 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). Dette er verdiene kalkulatoren starter med.

Hastighet = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Spesifikk aktivitet = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Eksempel 2. Samme betingelser, men enzymkonsentrasjonen er doblet til 2 mg/mL.

Hastighet = 33,33 µmol/(min·mL), uendret, siden hastigheten ikke avhenger av [E] i denne ligningen. Spesifikk aktivitet = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Når enzymmengden dobles, halveres den spesifikke aktiviteten, fordi den samme totale hastigheten nå fordeles på dobbelt så mye protein.

Eksempel 3. Substratet økes til 100 mM, langt over Km, med enzymkonsentrasjon 1 mg/mL, Km 5 mM og Vmax 50 µmol/(min·mL).

Hastighet = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Spesifikk aktivitet = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Ved høy substratkonsentrasjon er enzymet nesten mettet, så hastigheten ligger nær Vmax.

Eksempel 4. Substratet reduseres til 1 mM, under Km, med enzymkonsentrasjon 1 mg/mL, Km 5 mM og Vmax 50 µmol/(min·mL).

Hastighet = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Spesifikk aktivitet = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Under Km begrenser små mengder substrat reaksjonen, så både hastigheten og den spesifikke aktiviteten ligger betydelig under Vmax.

Forklaring av viktige parametere

Enzymkonsentrasjon [E] er massen av enzymprotein per volum, i mg/mL. En høyere verdi fordeler den samme reaksjonshastigheten på mer protein, noe som senker den spesifikke aktiviteten. Det er spesifikk aktivitet, ikke den rene konsentrasjonen, som viser om et enzympreparat fungerer godt.

Substratkonsentrasjon [S] er mengden substrat enzymet har til rådighet, vanligvis i mM. Ved lav [S] gir små økninger en kraftig økning i hastigheten. Nær metning gir ekstra substrat knapt noen effekt.

Michaelis-konstanten (Km) er substratkonsentrasjonen der hastigheten er lik halvparten av Vmax. En lav Km betyr at enzymet når halv hastighet ved lav substratkonsentrasjon, noe som tyder på sterk binding mellom enzym og substrat. Heksokinase har for eksempel en Km nær 0,1 mM for glukose, noe som viser høy affinitet.

Maksimalhastighet (Vmax) er hastigheten når substrat ikke lenger begrenser reaksjonen. Oppgi den i µmol/(min·mL), det samme som mM/min eller U/mL, slik at den samsvarer med mM-enheten som brukes for [S] og Km. Den avhenger av hvor mye enzym som er til stede, og hvor raskt hvert enzymmolekyl kan omsette substrat (omsetningstallet, kcat).

Reaksjonstid er hvor lenge analysen pågikk. Den er nyttig ved planlegging av et eksperiment, fordi en reaksjon som får gå for lenge, kan tømme substratet og slutte å oppføre seg lineært. Den inngår ikke i selve formelen for spesifikk aktivitet.

Slik leses hastighetskurven

Diagrammet viser hastighet mot substratkonsentrasjon ved hjelp av Michaelis-Menten-ligningen.

• Under Km: Hastigheten øker omtrent proporsjonalt med substratet. Små feil i substratkonsentrasjonen gir store feil i resultatet.
• Nær Km: Kurven bøyer av. Hastigheten er halvparten av Vmax.
• Over Km: Kurven flater ut. Ekstra substrat gir liten ekstra hastighet fordi enzymet nesten er mettet.

Hvorfor spesifikk aktivitet er viktig

Spesifikk aktivitet er et standardmål på enzymrenhet og -kvalitet. Under rensing følger forskere den ved hvert trinn: Et rått celleekstrakt kan vise noen få U/mg, mens en høyrenset prøve kan nå hundrevis eller tusenvis av U/mg. En økende spesifikk aktivitet gjennom en renseprosess viser at inaktivt protein fjernes, mens enzymet man er interessert i, beholdes.

Den samme målingen brukes i legemiddelutvikling, der forskere undersøker hvordan kandidatforbindelser reduserer aktiviteten til et enzym, og i klinisk diagnostikk, der leger måler enzymer som ALT og AST i blodet for å kontrollere leverskade.

Ofte stilte spørsmål

Hvordan beregnes enzymaktivitet ut fra Km og Vmax? Finn først reaksjonshastigheten med Michaelis-Menten-ligningen, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Del deretter på enzymkonsentrasjonen for å få spesifikk aktivitet i U/mg: Aktivitet = v / [E]. Bruk Vmax i µmol/(min·mL) og [E] i mg/mL, slik at enhetene forkortes til U/mg.

Hva er en enhet (U) enzymaktivitet? Én enhet er mengden enzym som under angitte betingelser omdanner 1 µmol substrat per minutt, slik det er definert av IUBMB.

Hvorfor inneholder ikke formelen reaksjonstid? Vmax er allerede uttrykt som en mengde per minutt, så det er en hastighet, ikke en total mengde. Hvis man deler på tid en gang til, telles tiden dobbelt, og resultatet vil avhenge av hvor lenge analysen pågikk. Det skal ikke skje for en egenskap ved selve enzymet.

Hvorfor synker den spesifikke aktiviteten når enzymkonsentrasjonen øker? Hastigheten i Michaelis-Menten-ligningen avhenger ikke av enzymkonsentrasjonen. Spesifikk aktivitet deler denne faste hastigheten på [E], så en større [E] gir et mindre resultat. Enzympreparater med ulik konsentrasjon sammenlignes på en rettferdig måte ved å sammenligne spesifikk aktivitet, ikke ren hastighet.

Hva betyr en lav Km? En lav Km betyr at enzymet når halvparten av maksimalhastigheten ved lav substratkonsentrasjon, noe som viser at enzymet og substratet binder seg tett.

Kan spesifikk aktivitet være negativ? Nei. Et negativt resultat tyder på en feil i inndataene, for eksempel en negativ konsentrasjon, eller en beregningsfeil, ikke en reell enzymmåling.

Referanser

1. Michaelis, L., & Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2012). Biochemistry (7. utg.). W.H. Freeman and Company.
3. International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Enzyme Nomenclature. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. BRENDA Enzyme Database. https://www.brenda-enzymes.org/