qPCR Effektivitetsberegner: Standardkurve Analyseverktøy

Beregner for qPCR-effektivitet

En beregner for qPCR-effektivitet anslår hvor godt en kvantitativ PCR-reaksjon (qPCR) kopierer mål-DNA-sekvensen i hver amplifikasjonssyklus. Den bruker Ct-verdier (syklusnummeret der fluorescenssignalet krysser en fastsatt terskel) fra en fortynningsserie til å beregne effektivitet, stigningstall, skjæringspunkt og R².

Hva er qPCR-effektivitet?

Kvantitativ PCR måler fluorescens mens en reaksjon kopierer en mål-DNA-sekvens, syklus for syklus. Amplifikasjonseffektivitet beskriver hvor mye mengden mål-DNA øker i hver syklus. Ved en effektivitet på 100 % dobles mengden mål-DNA i hver syklus.

Reelle reaksjoner når sjelden nøyaktig 100 %. De fleste laboratorier regner en effektivitet mellom 90 % og 110 % som akseptabel for pålitelig kvantifisering. En verdi under 90 % eller over 110 % tyder på et problem, for eksempel dårlig primerdesign, PCR-hemmere som er blitt med fra prøveekstraksjonen, eller pipetteringsfeil i fortynningsserien.

Effektivitet er viktigst ved sammenligning av genuttrykk mellom prøver. Den vanlige ΔΔCt-metoden for beregning av fold-endring forutsetter at alle reaksjoner har en effektivitet på 100 %. Når den målte effektiviteten avviker fra 100 %, eller når et målgen og et referansegen har ulik effektivitet, kan resultatene for fold-endring bli unøyaktige.

Formel for qPCR-effektivitet

Effektivitet beregnes ut fra stigningstallet til standardkurven, en linje som dannes ved å plotte Ct-verdier mot den base-10-logaritmen (log10) av mengden start-DNA i en fortynningsserie.

E = 10^(-1/stigningstall) - 1

E er effektivitet, uttrykt som et desimaltall (multipliser med 100 for å få prosent). Stigningstall er stigningstallet til standardkurven. Det er negativt fordi Ct øker når mengden start-DNA synker.

Et stigningstall på -3,32 tilsvarer 100 % effektivitet:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Dette stemmer fordi en 10-gangs fortynning bør forskyve Ct med omtrent 3,32 sykluser hvis reaksjonen dobler DNA-mengden i hver syklus, siden log2(10) er omtrent 3,32.

I praksis regnes et stigningstall mellom -3,1 og -3,6 som akseptabelt. Dette området tilsvarer en effektivitet på omtrent 90 % til 110 %. Et stigningstall nærmere -3,1 gir en høyere beregnet effektivitet, mens et stigningstall nærmere -3,6 gir en lavere effektivitet.

Slik beregnes qPCR-effektivitet: metoden med standardkurve

1. Lag en fortynningsserie. Begynn med den mest konsentrerte prøven og fortynn den med en fast faktor, vanligvis 10 ganger, for hver påfølgende prøve. Kjør qPCR på hver fortynning og registrer Ct-verdien.
2. Konverter hver fortynning til en log10-verdi. Når den første og mest konsentrerte prøven regnes som posisjon 0, har prøvenummer i log10(relativ mengde) lik -i × log10(fortynningsfaktor).
3. Plott Ct (vertikal akse) mot log10-verdien (horisontal akse) for hver fortynning, og utfør en lineær regresjon.
4. Les av stigningstallet, skjæringspunktet og R² for regresjonslinjen.
5. Sett stigningstallet inn i E = 10^(-1/stigningstall) - 1 for å finne effektiviteten.

Kvalitetskriterier for standardkurven

• R² på minst 0,98. Dette måler hvor godt punktene passer til en rett linje. En lavere verdi tyder ofte på pipetteringsfeil eller ujevn amplifikasjon.
• Stigningstall mellom -3,1 og -3,6. Dette området tilsvarer 90–110% effektivitet.
• Minst tre fortynningspunkter. Fem eller seks punkter gir en mer pålitelig linje og gjør det lettere å oppdage et avvikende punkt.
• Den mest konsentrerte prøven bør gi en Ct-verdi rundt 15-20. Den mest fortynnede prøven bør holde seg under Ct 35, siden verdier over dette nærmer seg deteksjonsgrensen.

Regneeksempel

En fortynningsserie med fem punkter og 10-gangs fortynning gir følgende Ct-verdier, fra mest til minst konsentrert: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Verdiene for log10(relativ mengde) er 0, -1, -2, -3, -4, fordi hvert fortynningstrinn gir -log10(10), eller -1. Ct øker med 3,5 sykluser ved hvert trinn, slik at punktene ligger på en rett linje, og lineær regresjon gir:

• Stigningstall: -3,5
• Skjæringspunkt: 15,0
• R²: 1,0

Effektivitet: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, eller omtrent 93 %.

En effektivitet på 93 % med R² = 1,0 oppfyller standard kvalitetskriterier og er egnet for kvantifisering av genuttrykk.

Kodeeksempel

Denne JavaScript-funksjonen følger samme metode som beregneren. Indeksen for hver Ct-verdi gjøres negativ før logaritmen beregnes, fordi den første og mest konsentrerte prøven har høyest relativ mengde, og hver påfølgende prøve er mer fortynnet.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Hvorfor effektivitet er viktig for genuttrykk

Beregninger av fold-endring, inkludert ΔΔCt-metoden, forutsetter at alle reaksjoner dobler målsekvensen i hver syklus. Når et målgen og et referansegen har ulik målt effektivitet, introduserer den enkle ΔΔCt-formelen feil. Forskere går ofte over til en effektivitetskorrigert beregning, for eksempel metoden Michael Pfaffl beskrev i 2001, når effektivitetene avviker med mer enn omtrent fem prosentpoeng. MIQE-retningslinjene, et mye sitert sett med rapporteringsstandarder for qPCR publisert i 2009, anbefaler at studier rapporterer beregnet effektivitet, stigningstall og R² sammen med kvantifiseringsresultatene.

Ofte stilte spørsmål

Hva er en god qPCR-effektivitet i prosent?

Mellom 90 % og 110 % aksepteres vanligvis, mens godt optimaliserte analyser ligger rundt 95–105%. Et stigningstall på -3,32 tilsvarer nøyaktig 100 %.

Hvorfor er qPCR-effektiviteten min over 110 %?

Vanlige årsaker er pipetteringsfeil i fortynningsserien, primer-dimerer, hemmere som påvirker konsentrerte og fortynnede prøver ulikt, eller en fluorescensterskel som er satt utenfor den eksponentielle fasen av amplifikasjonen. En smeltekurve med mer enn én topp kan tyde på primer-dimerer.

Hvorfor er qPCR-effektiviteten min under 90 %?

Sannsynlige årsaker er dårlig utforming av primerne, PCR-hemmere som er blitt med fra prøveekstraksjonen, eller en lite egnet annealing-temperatur. Kontroll av primerens spesifisitet og kjøring av en temperaturgradient kan bidra til å finne årsaken.

Hva betyr en lav R²-verdi?

R² måler hvor godt Ct-verdiene passer til en rett linje mot logaritmen av mengden. En verdi under 0,98 tyder på ujevn pipettering, en hemmet prøve eller et fortynningspunkt nær deteksjonsgrensen.

Hvor mange fortynningspunkter trenger en standardkurve?

Minst tre, som er minimumet som trengs for en lineær regresjon. Fem eller seks punkter gir et mer pålitelig stigningstall og gjør det lettere å oppdage avvikende punkter.

Kan effektiviteten endres mellom eksperimenter?

Ja. Et nytt reagensparti, en ny primerbatch, en annen prøvetype eller et annet qPCR-instrument kan forskyve effektiviteten. Mange laboratorier kontrollerer effektiviteten på nytt med noen måneders mellomrom eller ved hvert nytt reagensparti.

Referanser

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE-retningslinjene: minimumsinformasjon for publisering av kvantitative sanntids-PCR-eksperimenter. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. En ny matematisk modell for relativ kvantifisering i sanntids-RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Hvor god er et estimat av PCR-effektivitet: anbefalinger for presis og pålitelig vurdering av qPCR-effektivitet. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.