Proteinkonsentrasjonsberegner | A280 til mg/mL

Kalkulator for proteinkonsentrasjon

En kalkulator for proteinkonsentrasjon omdanner en måling av lysabsorbans fra et spektrofotometer til mengden protein som er oppløst i en løsning. Resultatet oppgis vanligvis i milligram per milliliter (mg/mL) eller mikrogram per milliliter (μg/mL). Beregningen er basert på Beer-Lamberts lov, en sammenheng i kjemien som knytter hvor mye lys en prøve absorberer, til hvor mye av et stoff den inneholder.

Hvordan proteinkonsentrasjon måles

De fleste proteiner absorberer ultrafiolett lys sterkt ved en bølgelengde på 280 nanometer (nm). Denne absorpsjonen skyldes hovedsakelig to aminosyrer, tryptofan og tyrosin, som finnes i proteinets struktur. Et spektrofotometer sender lys gjennom prøven og måler hvor mye av lyset prøven absorberer. Denne målingen kalles absorbans, eller A280 når den er utført ved 280 nm.

Måling av absorbans ved 280 nm går raskt og ødelegger ikke prøven. Det skiller metoden fra kjemiske metoder som Bradford- eller BCA-analyse, beskrevet nedenfor. Metoden fungerer best for et renset protein i løsning, med en absorbansmåling mellom omtrent 0,1 og 1,0. Målinger utenfor dette området er mindre pålitelige, så en prøve må ofte fortynnes før måling.

Formel for proteinkonsentrasjon

Kalkulatoren omformer Beer-Lamberts lov for å løse med hensyn på konsentrasjonen:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — proteinkonsentrasjon, i mg/mL
• A — absorbans ved 280 nm (et rent tall uten enhet)
• DF — fortynningsfaktor, hvor mange ganger den opprinnelige prøven ble fortynnet før den ble målt
• ε — ekstinksjonskoeffisient, en konstant som er spesifikk for proteinet, i L/(g·cm)
• l — lysvei, avstanden lyset beveger seg gjennom prøven, i cm (vanligvis 1 cm i en standardkuvette, en liten beholder av glass eller plast som brukes i spektrofotometeret)

For å omregne resultatet til mikrogram per milliliter multipliseres verdien i mg/mL med 1 000. For å finne den totale proteinmassen i prøven multipliseres konsentrasjonen med prøvens volum i milliliter.

Regneeksempel

En prøve gir en absorbansmåling på 0,5 ved 280 nm. Den ble ikke fortynnet, så fortynningsfaktoren er 1, og den ble målt i en standardkuvette på 1 cm. Proteinet er bovint serumalbumin (BSA), som har en ekstinksjonskoeffisient på 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

I en prøve på 1 mL tilsvarer det omtrent 0,75 mg totalt protein, eller 750 μg/mL.

Ekstinksjonskoeffisienter for vanlige proteiner

Hvert protein absorberer lys på ulik måte fordi de har forskjellig antall tryptofan- og tyrosinrester. Ekstinksjonskoeffisienten beskriver dette for et bestemt protein ved 280 nm, i enheten L/(g·cm). Vanlig brukte verdier omfatter:

En kalkulator kan også ta imot en egendefinert ekstinksjonskoeffisient for et protein som ikke står på denne listen. For et protein med kjent aminosyresekvens kan denne verdien beregnes med en formel publisert av Gill og von Hippel i 1989: ε₂₈₀ = (tryptofanrester × 5 500) + (tyrosinrester × 1 490) + (cystinrester × 125). Denne formelen gir et resultat i M⁻¹cm⁻¹, en molar enhet som skiller seg fra de massebaserte verdiene i L/(g·cm) ovenfor. Gratis verktøy som ProtParam, som driftes av ExPASy-serveren, beregner denne verdien direkte fra en proteinsekvens.

Lysvei og fortynningsfaktor

Lysveien er bredden på kuvetten som inneholder prøven, målt i centimeter. Standardkuvetter er 1 cm brede. Mikrovolum-spektrofotometre, som måler svært små prøver, kan bruke en mye kortere lysvei, for eksempel 0,1 cm.

Fortynningsfaktoren tar hensyn til all fortynning som er utført før målingen. Hvis en konsentrert prøve ville gitt en absorbans over 1,0, er det vanlig å fortynne den med buffer først. Fortynningsfaktoren er lik det totale fortynnede volumet delt på det opprinnelige prøvevolumet. Hvis man for eksempel blander 10 μL prøve med 990 μL buffer, blir totalvolumet 1 000 μL og fortynningsfaktoren 100.

Andre metoder for å måle proteinkonsentrasjon

Absorbans ved 280 nm er én av flere vanlige metoder som brukes i laboratoriet.

• Bradford-analyse: bruker et fargestoff som endrer farge når det binder seg til protein. Den fungerer godt på urensede prøver, men fargeendringen kan variere mellom ulike proteiner.
• BCA-analyse: bygger på en fargeendring som skyldes proteinets peptidbindinger. Den er kompatibel med mange detergenter, men tar lengre tid å utføre enn en direkte absorbansmåling.
• Lowry-metoden: en eldre metode som er svært følsom, men som reagerer dårlig med enkelte vanlige bufferkomponenter.

Alle disse tre metodene ødelegger prøven. En direkte A280-måling gjør ikke det, så den samme prøven kan tas vare på og brukes igjen.

Ofte stilte spørsmål

Hva er det ideelle absorbansområdet for denne metoden?

Mellom 0,1 og 1,0. Under 0,1 er målingen upresis. Over 1,0 er forholdet mellom absorbans og konsentrasjon kanskje ikke lenger en rett linje, så prøven bør fortynnes først.

Hvorfor måle ved 280 nm i stedet for 260 nm?

Nukleinsyrer, som DNA og RNA, absorberer sterkt ved 260 nm. Proteiner absorberer mer ved 280 nm på grunn av innholdet av tryptofan og tyrosin. Måling ved 280 nm reduserer forstyrrelser fra eventuelle nukleinsyrer i prøven.

Hvordan finner man ekstinksjonskoeffisienten for et protein som ikke står på listen?

For et protein med kjent sekvens beregner et verktøy som ProtParam den ut fra antallet tryptofan-, tyrosin- og cystinrester. Den kan også måles direkte ved å sammenligne prøvens absorbans med en løsning med kjent konsentrasjon.

Fungerer denne metoden for en blanding av proteiner?

Den fungerer best for ett enkelt, renset protein med kjent ekstinksjonskoeffisient. En blanding av ukjente proteiner, for eksempel et cellelysat, måles vanligvis med Bradford- eller BCA-analyse i stedet, siden disse metodene gir et mer konsistent estimat av den totale proteinmengden.

Kan detergenter forstyrre målingen?

Ja. Mange detergenter absorberer lys nær 280 nm, noe som kan forvrenge resultatet. Ved å bruke en blindprøve som inneholder samme detergentkonsentrasjon, kan denne bakgrunnsabsorbansen nøytraliseres. Svært høye detergentkonsentrasjoner kan gjøre det nødvendig å bruke en detergentkompatibel analyse, for eksempel BCA.