Beregn presise prøvevolumer basert på BCA-assays absorbansmålinger og ønsket proteinmasse. Viktig for konsekvent proteinlasting i western blots og andre laboratorieapplikasjoner.
Dette verktøyet beregner det nødvendige prøvevolumet basert på BCA-absorberingsresultater og prøvevekt. Skriv inn absorberingsverdien og prøvevekten for hver prøve for å beregne det tilsvarende prøvevolumet.
Prøvevolumet beregnes ved hjelp av følgende formel:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbansprøvevolumkalkulatoren er et spesialisert verktøy designet for å hjelpe forskere og laboratorieteknikere med å nøyaktig bestemme det passende prøvevolumet for eksperimenter basert på BCA (bicinchoninsyre) assayresultater. Denne kalkulatoren tar absorbansavlesningene fra BCA assayet ditt og din ønskede prøvevekt for å beregne det nøyaktige volumet som trengs for konsistent proteininnlasting i applikasjoner som western blotting, enzymatiske assay og andre proteinanalyse teknikker.
BCA assayet er en av de mest brukte metodene for protein kvantifisering i biokjemi- og molekylærbiologilaboratorier. Ved å måle absorbansen av proteinprøvene dine og sammenligne dem med en standardkurve, kan du bestemme protein konsentrasjonen med høy nøyaktighet. Vår kalkulator strømlinjeformer denne prosessen ved automatisk å konvertere absorbansavlesninger til de eksakte prøvevolumene som kreves for eksperimentene dine.
Bicinchoninsyre (BCA) assayet er en biokjemisk assay for å bestemme den totale konsentrasjonen av protein i en løsning. Prinsippet for denne assayet er basert på dannelsen av et Cu²⁺-protein kompleks under alkaliske forhold, etterfulgt av reduksjon av Cu²⁺ til Cu¹⁺. Mengden reduksjon er proporsjonal med det tilstedeværende proteinet. BCA danner et lilla-farget kompleks med Cu¹⁺ i alkaliske miljøer, noe som gir et grunnlag for å overvåke reduksjonen av kobber av proteiner.
Intensiteten av den lilla fargen øker proporsjonalt med protein konsentrasjonen, som kan måles ved hjelp av en spektrofotometer ved omtrent 562 nm. Absorbansavlesningene sammenlignes deretter med en standardkurve for å bestemme protein konsentrasjonen i ukjente prøver.
Den grunnleggende formelen for å beregne prøvevolum fra BCA absorbansresultater er:
Hvor:
Proteinkonsentrasjonen beregnes fra absorbansavlesningen ved hjelp av en standardkurveformel:
For et standard BCA assay er den typiske hellingen omtrent 2.0, og interceptet er ofte nær null, selv om disse verdiene kan variere basert på dine spesifikke assayforhold og standardkurve.
Vår kalkulator forenkler prosessen med å bestemme prøvevolumer fra BCA assayresultater. Følg disse trinnene for å få nøyaktige beregninger:
Skriv inn Prøveinformasjon:
Velg Standardkurvetype:
Se Resultater:
Kopier eller Eksporter Resultater:
La oss gå gjennom et praktisk eksempel:
Dette betyr at du bør laste 13.33 μL av prøven din for å få 20 μg protein.
Kalkulatoren gir flere viktige informasjonselementer:
Proteinkonsentrasjon: Dette beregnes fra absorbansavlesningen ved hjelp av den valgte standardkurven. Det representerer mengden protein per enhet volum i prøven din (μg/μL).
Prøvevolum: Dette er volumet av prøven din som inneholder den ønskede mengden protein. Denne verdien er hva du vil bruke når du forbereder eksperimentene dine.
Advarsler og Anbefalinger: Kalkulatoren kan gi advarsler for:
En av de vanligste applikasjonene for denne kalkulatoren er forberedelse av prøver for western blotting. Konsistent proteininnlasting er avgjørende for pålitelige western blot-resultater, og denne kalkulatoren sikrer at du laster samme mengde protein for hver prøve, selv når konsentrasjonene varierer.
Eksempel arbeidsflyt:
For enzymatiske assays er det ofte nødvendig å bruke en spesifikk mengde protein for å standardisere reaksjonsbetingelsene på tvers av forskjellige prøver eller eksperimenter.
Eksempel arbeidsflyt:
I immunopresipitasjon (IP) eksperimenter er det viktig å starte med en konsistent mengde protein for å sammenligne resultater på tvers av forskjellige forhold.
Eksempel arbeidsflyt:
Under proteinrening er det ofte nødvendig å spore proteinkonsentrasjonen og beregne utbytter ved forskjellige trinn.
Eksempel arbeidsflyt:
Mens kalkulatoren gir standardparametere for standard BCA assay, kan du også skrive inn tilpassede verdier hvis du har generert din egen standardkurve. Dette er spesielt nyttig når:
For å bruke en tilpasset standardkurve:
Kalkulatoren lar deg legge til flere prøver og beregne volumene deres samtidig. Dette er spesielt nyttig når du forbereder prøver for eksperimenter som krever konsistent proteininnlasting på tvers av flere forhold.
Fordeler med batchprosessering:
Hvis absorbansavlesningen din er over 2.0, kan det være utenfor den lineære rekkevidden av BCA assayet. I slike tilfeller:
For absorbansavlesninger under 0.1 kan du være nær deteksjonsgrensen for assayet, noe som kan påvirke nøyaktigheten. Vurder:
Hvis kalkulatoren foreslår et volum som er for stort for applikasjonen din:
Den nøyaktige kvantifiseringen av proteiner har vært en grunnleggende nødvendighet i biokjemi og molekylærbiologi siden disse feltene oppsto. Tidlige metoder var avhengige av bestemmelse av nitrogeninnhold, som var tidkrevende og krevde spesialisert utstyr.
Kjeldahl Metode (1883): En av de tidligste metodene for protein kvantifisering, basert på å måle nitrogeninnhold.
Biuret Test (Tidlig 1900-tall): Denne metoden er basert på reaksjonen mellom peptidbindinger og kobberioner i en alkalisk løsning, som produserer en violet farge.
Lowry Assay (1951): Utviklet av Oliver Lowry, kombinerte denne metoden Biuret-reaksjonen med Folin-Ciocalteu-reagenseren, noe som økte følsomheten.
Bradford Assay (1976): Marion Bradford utviklet denne metoden ved å bruke Coomassie Brilliant Blue G-250-fargestoff, som binder seg til proteiner og endrer absorpsjonsmaksimum.
BCA Assay (1985): Utviklet av Paul Smith og kolleger ved Pierce Chemical Company, kombinerte denne metoden Biuret-reaksjonen med BCA-detektering, og tilbød forbedret følsomhet og kompatibilitet med rengjøringsmidler.
BCA assayet ble først beskrevet i en 1985-artikkel av Smith et al. med tittelen "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Det ble utviklet for å adressere begrensninger i eksisterende metoder, spesielt forstyrrelser fra ulike kjemikalier som ofte brukes i proteinutvinning og rensing.
Den viktigste innovasjonen var å bruke bicinchoninsyre for å detektere Cu¹⁺-ionene som produseres ved proteinmediert reduksjon av Cu²⁺, noe som danner et lilla-farget kompleks som kan måles spektrofotometrisk. Dette ga flere fordeler:
Siden introduksjonen har BCA assayet blitt en av de mest brukte metodene for protein kvantifisering i biokjemi og molekylærbiologi laboratorier over hele verden.
1=IF(B2<=0,"Feil: Ugyldig absorbans",IF(C2<=0,"Feil: Ugyldig prøvevekt",C2/(2*B2)))
2
3' Hvor:
4' B2 inneholder absorbansavlesningen
5' C2 inneholder ønsket prøvevekt i μg
6' Formelen returnerer det nødvendige prøvevolumet i μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Beregn proteinkonsentrasjon fra absorbans ved hjelp av standardkurve."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbans kan ikke være negativ")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Beregn nødvendig prøvevolum basert på absorbans og ønsket masse."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Prøvevekt må være positiv")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Beregnet proteinkonsentrasjon må være positiv")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Eksempel på bruk
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"For absorbans {absorbance} og ønsket proteinmasse {sample_mass} μg:")
31 print(f"Proteinkonsentrasjon: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Nødvendig prøvevolum: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Feil: {e}")
351# Funksjon for å beregne proteinkonsentrasjon fra absorbans
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbans kan ikke være negativ")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funksjon for å beregne prøvevolum
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Prøvevekt må være positiv")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Beregnet proteinkonsentrasjon må være positiv")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Eksempel på bruk
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("For absorbans %.2f og ønsket proteinmasse %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Proteinkonsentrasjon: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Nødvendig prøvevolum: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Feil: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbans kan ikke være negativ");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Prøvevekt må være positiv");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Beregnet proteinkonsentrasjon må være positiv");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Eksempel på bruk
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`For absorbans ${absorbance} og ønsket proteinmasse ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Proteinkonsentrasjon: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Nødvendig prøvevolum: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Feil: ${error.message}`);
37}
38Forholdet mellom absorbans og proteinkonsentrasjon er vanligvis lineært innenfor et bestemt område. Nedenfor er en visualisering av en standard BCA-kurve:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Ulike protein kvantifiseringsmetoder har forskjellige fordeler og begrensninger. Her er hvordan BCA assayet sammenlignes med andre vanlige metoder:
| Metode | Følsomhetsområde | Fordeler | Begrensninger | Best For |
|---|---|---|---|---|
| BCA Assay | 5-2000 μg/mL | • Kompatibel med rengjøringsmidler • Mindre protein-til-protein variasjon • Stabil fargeutvikling | • Forstyrret av reduserende midler • Påvirket av noen chelateringsmidler | • Generell protein kvantifisering • Prøver som inneholder rengjøringsmidler |
| Bradford Assay | 1-1500 μg/mL | • Rask (2-5 min) • Få forstyrrende stoffer | • Høy protein-til-protein variasjon • Inkompatibel med rengjøringsmidler | • Hurtigmålinger • Rengjøringsmiddel-frie prøver |
| Lowry Metode | 1-1500 μg/mL | • Veletablert • God følsomhet | • Mange forstyrrende stoffer • Flere trinn | • Historisk konsistens • Rene proteinprøver |
| UV Absorbans (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Ikke-destruktiv • Veldig rask • Ingen reagenser nødvendig | • Påvirket av nukleinsyrer • Krever rene prøver | • Rene proteinløsninger • Hurtigsjekker under rensing |
| Fluorometrisk | 0.1-500 μg/mL | • Høyeste følsomhet • Bredt dynamisk område | • Dyre reagenser • Krever fluorometer | • Veldig fortynnede prøver • Begrenset prøvevolum |
BCA (bicinchoninsyre) assayet brukes primært til å kvantifisere den totale proteinkonsentrasjonen i en prøve. Det er mye brukt i biokjemi, cellebiologi og molekylærbiologi for applikasjoner som western blotting, enzymassays, immunopresipitasjon og proteinrensing.
BCA assayet er generelt nøyaktig innen 5-10% når det utføres korrekt. Nøyaktigheten avhenger av flere faktorer, inkludert kvaliteten på standardkurven, fraværet av forstyrrende stoffer, og om sammensetningen av det ukjente proteinet er lik standardproteinet som brukes.
Flere stoffer kan forstyrre BCA assayresultatene, inkludert:
De viktigste forskjellene er:
Hvis kalkulatoren viser et veldig stort prøvevolum, indikerer det vanligvis en lav proteinkonsentrasjon i prøven din. Dette kan skyldes:
Vurder å konsentrere prøven din eller justere eksperimentdesignet for å imøtekomme den lavere proteinkonsentrasjonen.
Denne kalkulatoren er spesifikt designet for BCA assayresultater. Selv om det grunnleggende prinsippet (å konvertere konsentrasjon til volum) gjelder for andre metoder, varierer forholdet mellom absorbans og proteinkonsentrasjon mellom forskjellige assays. For andre metoder som Bradford eller Lowry, må du bruke forskjellige standardkurveparametere.
For absorbansavlesninger utenfor den lineære rekkevidden (typisk >2.0):
Bovin serumalbumin (BSA) er den mest brukte standarden for BCA assays fordi det er:
Men hvis prøvene dine inneholder et dominerende protein som avviker betydelig fra BSA, vurder å bruke det proteinet som standard for mer nøyaktige resultater.
Den lilla fargen som utvikles i BCA-reaksjonen er stabil i flere timer ved romtemperatur og kan måles når som helst innen den perioden. Imidlertid anbefales det for best resultat å måle alle standarder og prøver omtrent samtidig etter fargeutvikling.
Selv om det teknisk sett er mulig å gjenbruke en standardkurve, anbefales det ikke for nøyaktig kvantifisering. Variasjoner i reagenser, inkubasjonsforhold og instrumentkalibrering kan påvirke forholdet mellom absorbans og proteinkonsentrasjon. For pålitelige resultater, generer en fersk standardkurve hver gang du utfører assayet.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instruksjoner. Tilgjengelig på: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Nå som du forstår prinsippene bak BCA protein kvantifisering og prøvevolumberegning, prøv vår kalkulator for å strømlinjeforme laboratoriearbeidsflyten din. Skriv ganske enkelt inn absorbansavlesningene dine og ønsket prøvevekt for å få umiddelbare, nøyaktige prøvevolumberegninger.
Enten du forbereder prøver for western blotting, enzymatiske assays eller andre proteinbaserte eksperimenter, vil kalkulatoren vår hjelpe deg med å sikre konsistente og pålitelige resultater. Spar tid, reduser feil og forbedre reproduksjonen av eksperimentene dine med BCA Absorbansprøvevolumkalkulatoren.
Oppdag flere verktøy som kan være nyttige for arbeidsflyten din