Calculator de Eficiență qPCR: Instrument de Analiză a Curbei Standard

Calculator pentru eficiența qPCR

Un calculator pentru eficiența qPCR estimează cât de bine copiază o reacție de PCR cantitativ (qPCR) secvența de ADN țintă la fiecare ciclu de amplificare. Acesta folosește valorile Ct (numărul ciclului la care semnalul fluorescent depășește un prag stabilit) dintr-o serie de diluții pentru a calcula eficiența, panta, ordonata la origine și R².

Ce este eficiența qPCR?

PCR-ul cantitativ urmărește fluorescența pe măsură ce o reacție copiază secvența de ADN țintă, ciclu după ciclu. Eficiența amplificării descrie cât crește cantitatea de ADN țintă la fiecare ciclu. La o eficiență de 100 %, cantitatea de ADN țintă se dublează la fiecare ciclu.

Reacțiile reale ating rareori exact 100 %. Majoritatea laboratoarelor consideră acceptabilă, pentru o cuantificare fiabilă, o eficiență între 90 % și 110 %. O valoare sub 90 % sau peste 110 % indică o problemă, cum ar fi proiectarea necorespunzătoare a primerilor, inhibitorii PCR transferați din extracția probei sau erorile de pipetare din seria de diluții.

Eficiența contează cel mai mult la compararea expresiei genice între probe. Metoda uzuală ΔΔCt pentru calcularea variației relative presupune că eficiența fiecărei reacții este de 100 %. Când eficiența măsurată diferă de 100 % sau când o genă țintă și o genă de referință au eficiențe diferite, rezultatele variației relative pot fi inexacte.

Formula eficienței qPCR

Eficiența se calculează din panta curbei standard, o dreaptă obținută prin reprezentarea valorilor Ct în funcție de logaritmul în baza 10 (log10) al cantității de ADN inițiale dintr-o serie de diluții.

E = 10^(-1/panta) - 1

E este eficiența, exprimată ca număr zecimal (se înmulțește cu 100 pentru exprimarea în procente). Panta este panta dreptei curbei standard. Ea este negativă, deoarece Ct crește pe măsură ce cantitatea de ADN inițial scade.

O pantă de -3,32 corespunde unei eficiențe de 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Acest rezultat apare deoarece o diluție de 10 ori ar trebui să deplaseze Ct cu aproximativ 3,32 cicluri dacă reacția își dublează ADN-ul la fiecare ciclu, deoarece log2(10) este aproximativ 3,32.

În practică, o pantă între -3,1 și -3,6 este considerată acceptabilă. Acest interval corespunde unei eficiențe de aproximativ 90 % până la 110 %. O pantă mai apropiată de -3,1 oferă o eficiență calculată mai mare; o pantă mai apropiată de -3,6 oferă o eficiență mai mică.

Cum se calculează eficiența qPCR: metoda curbei standard

Pregătiți o serie de diluții. Porniți de la proba cu concentrația cea mai mare și diluați-o cu un factor fix, de obicei de 10 ori, pentru fiecare probă următoare. Efectuați qPCR pentru fiecare diluție și înregistrați valoarea Ct.
Convertiți fiecare diluție într-o valoare log10. Considerând prima probă, cu concentrația cea mai mare, ca poziția 0, proba cu numărul i are log10(cantitate relativă) egal cu -i × log10(factorul de diluție).
Reprezentați Ct (pe axa verticală) în funcție de valoarea log10 (pe axa orizontală) pentru fiecare diluție și efectuați o regresie liniară.
Determinați panta, ordonata la origine și R² ale dreptei de regresie.
Introduceți panta în E = 10^(-1/panta) - 1 pentru a obține eficiența.

Criterii de calitate pentru curba standard

R² de cel puțin 0,98. Acesta măsoară cât de bine se potrivesc punctele pe o dreaptă. O valoare mai mică indică adesea erori de pipetare sau o amplificare neuniformă.
Pantă între -3,1 și -3,6. Acest interval corespunde unei eficiențe de 90–110%.
Cel puțin trei puncte de diluție. Cinci sau șase puncte oferă o dreaptă mai fiabilă și facilitează identificarea unei valori aberante.
Proba cu concentrația cea mai mare ar trebui să aibă un Ct de aproximativ 15-20. Proba cu diluția cea mai mare ar trebui să rămână sub Ct 35, deoarece valorile de peste acest nivel se apropie de limita de detecție.

Exemplu de calcul

O serie de diluții în cinci puncte, de 10 ori, oferă următoarele valori Ct, de la concentrația cea mai mare la cea mai mică: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Valorile log10(cantitate relativă) sunt 0, -1, -2, -3, -4, deoarece fiecare etapă de diluție adaugă -log10(10), adică -1. Ct crește cu 3,5 cicluri la fiecare etapă, astfel încât punctele se află pe o dreaptă, iar regresia liniară dă:

Pantă: -3,5
Ordonată la origine: 15,0
R²: 1,0

Eficiență: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, adică aproximativ 93 %.

O eficiență de 93 % cu R² = 1,0 îndeplinește criteriile standard de calitate și este adecvată pentru cuantificarea expresiei genice.

Exemplu de cod

Această funcție JavaScript urmează aceeași metodă ca și calculatorul. Semnul indicelui fiecărei valori Ct este schimbat înainte de calcularea logaritmului, deoarece prima probă, cu concentrația cea mai mare, are cantitatea relativă cea mai mare, iar fiecare probă următoare este mai diluată.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

De ce contează eficiența pentru expresia genică

Calculele variației relative, inclusiv metoda ΔΔCt, presupun că fiecare reacție dublează cantitatea țintei la fiecare ciclu. Când o genă țintă și o genă de referință au eficiențe măsurate diferite, formula simplă ΔΔCt introduce erori. Cercetătorii trec adesea la un calcul corectat pentru eficiență, precum metoda descrisă de Michael Pfaffl în 2001, atunci când eficiențele diferă cu mai mult de aproximativ cinci puncte procentuale. Ghidurile MIQE, un set de standarde de raportare qPCR citat pe scară largă, publicat în 2009, recomandă ca studiile să raporteze eficiența calculată, panta și R² împreună cu rezultatele cuantificării.

Întrebări frecvente

Care este un procent bun al eficienței qPCR?

Un interval între 90 % și 110 % este acceptat în general, iar testele bine optimizate ajung la aproximativ 95–105%. O pantă de -3,32 corespunde exact unei eficiențe de 100 %.

De ce este eficiența qPCR peste 110 %?

Printre cauzele frecvente se numără erorile de pipetare din seria de diluții, dimerii de primeri, inhibitorii care afectează în mod diferit probele concentrate și pe cele diluate sau un prag de fluorescență stabilit în afara fazei exponențiale a amplificării. O curbă de topire cu mai mult de un vârf poate indica prezența dimerilor de primeri.

De ce este eficiența qPCR sub 90 %?

Printre cauzele probabile se numără proiectarea necorespunzătoare a primerilor, inhibitorii PCR transferați din extracția probei sau o temperatură de hibridizare suboptimă. Verificarea specificității primerilor și efectuarea unei variații graduale a temperaturii pot ajuta la identificarea cauzei.

Ce înseamnă o valoare R² mică?

R² măsoară cât de bine se potrivesc valorile Ct pe o dreaptă în funcție de cantitatea exprimată logaritmic. O valoare sub 0,98 sugerează inconsistență la pipetare, o probă inhibată sau un punct de diluție apropiat de limita de detecție.

De câte puncte de diluție are nevoie o curbă standard?

Cel puțin trei, numărul minim necesar pentru o regresie liniară. Cinci sau șase puncte oferă o pantă mai fiabilă și facilitează identificarea valorilor aberante.

Se poate schimba eficiența între experimente?

Da. Un lot nou de reactivi, un lot nou de primeri, un tip diferit de probă sau un alt instrument qPCR pot modifica eficiența. Multe laboratoare verifică din nou eficiența la fiecare câteva luni sau cu fiecare lot nou de reactivi.

Referințe

Bustin SA, Benes V, Garson JA și colab. Ghidurile MIQE: informații minime pentru publicarea experimentelor cantitative de PCR în timp real. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
Pfaffl MW. Un nou model matematic pentru cuantificarea relativă în RT-PCR în timp real. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Cât de bună este estimarea eficienței PCR: recomandări pentru evaluarea precisă și fiabilă a eficienței qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.

Calculator de Eficiență qPCR: Instrument de Analiză a Curbei Standard