Calculator de Ligation a ADN

Introducere

Ligationa ADN este o tehnică critică în biologia moleculară utilizată pentru a uni fragmentele de ADN împreună cu legături covalente. Calculatorul de Ligation a ADN este un instrument esențial pentru cercetători, ajutând la determinarea cantităților optime de ADN vector și insert necesare pentru reacții de ligare de succes. Prin calcularea raporturilor molare corecte între ADN-ul vector (plasmid) și fragmentele de ADN insert, acest calculator asigură experimente eficiente de clonare moleculară, minimizând reactivii irosiți și reacțiile eșuate.

Reacțiile de ligare sunt fundamentale pentru ingineria genetică, biologia sintetică și procedurile de clonare moleculară. Ele permit oamenilor de știință să creeze molecule de ADN recombinant prin inserarea genelor de interes în vectori plasmidici pentru transformarea ulterioară în organisme gazdă. Succesul acestor reacții depinde în mare măsură de utilizarea cantităților adecvate de componente ADN, ceea ce este exact ceea ce acest calculator ajută să se determine.

Indiferent dacă construiești vectori de expresie, creezi biblioteci de gene sau efectuezi subclonări de rutină, acest calculator de ligation a ADN te va ajuta să optimizezi condițiile experimentale și să îți crești rata de succes. Prin introducerea câtorva parametrii cheie despre probele tale de ADN, poți obține rapid volumele exacte necesare pentru reacția ta specifică de ligare.

Formula/Calcul

Calculatorul de ligation a ADN folosește o formulă fundamentală din biologia moleculară care ține cont de dimensiunile și concentrațiile diferitelor fragmente de ADN care sunt unite. Calculul principal determină cât de mult ADN insert este necesar în raport cu ADN-ul vector pe baza lungimii lor respective și a raportului molar dorit.

Calculul Cantității de Insert

Cantitatea de ADN insert necesară (în nanograme) se calculează folosind următoarea formulă:

$\text{ng de insert} = \text{ng de vector} \times \frac{\text{kb dimensiunea insert}}{\text{kb dimensiunea vector}} \times \text{raport molar}$

Unde:

ng de vector = cantitatea de ADN vector utilizată în reacție (de obicei 50-100 ng)
kb dimensiunea insert = lungimea fragmentului de ADN insert în kilobaze (kb)
kb dimensiunea vector = lungimea ADN-ului vector în kilobaze (kb)
raport molar = raportul dorit de molecule insert la molecule vector (de obicei 3:1 până la 5:1)

Calculul Volumelor

Odată ce cantitatea necesară de ADN insert este determinată, volumele necesare pentru reacție sunt calculate:

$\text{Volumul vector (μL)} = \frac{\text{ng de vector}}{\text{concentrarea vector (ng/μL)}}$

$\text{Volumul insert (μL)} = \frac{\text{ng de insert}}{\text{concentrarea insert (ng/μL)}}$

$\text{Volumul buffer/apă (μL)} = \text{Volumul total al reacției (μL)} - \text{Volumul vector (μL)} - \text{Volumul insert (μL)}$

Exemplu de Calcul

Să lucrăm printr-un exemplu practic:

Concentrarea vector: 50 ng/μL
Lungimea vector: 3000 bp (3 kb)
Concentrarea insert: 25 ng/μL
Lungimea insert: 1000 bp (1 kb)
Raportul molar dorit (insert:vector): 3:1
Volumul total al reacției: 20 μL
Cantitatea de vector utilizată: 50 ng

Pasul 1: Calculează cantitatea necesară de insert $\text{ng de insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Pasul 2: Calculează volumele $\text{Volumul vector} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Volumul insert} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Volumul buffer/apă} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Această calculare asigură că există trei molecule de insert pentru fiecare moleculă de vector în reacție, optimizând șansele de ligare de succes.

Ghid Pas cu Pas pentru Utilizarea Calculatorului

Calculatorul nostru de Ligation a ADN este conceput pentru a fi intuitiv și simplu. Urmează acești pași pentru a calcula volumele optime pentru reacția ta de ligare:

Introdu informațiile despre vector:
- Introdu concentrarea vectorului tău în ng/μL
- Introdu lungimea vectorului în baze (bp)
- Specifică cantitatea de ADN vector pe care vrei să o folosești în reacție (ng)
Introdu informațiile despre insert:
- Introdu concentrarea insertului tău în ng/μL
- Introdu lungimea insertului în baze (bp)
Setează parametrii reacției:
- Specifică raportul molar dorit (insert:vector) - de obicei între 3:1 și 5:1
- Introdu volumul total al reacției în μL (de obicei 10-20 μL)
Vizualizează rezultatele:
- Calculatorul va afișa automat:
  - Volumul vectorului necesar (μL)
  - Volumul insertului necesar (μL)
  - Volumul buffer/apă de adăugat (μL)
  - Volumul total al reacției (μL)
  - Cantitatea de ADN vector și insert în reacție (ng)
Copiază rezultatele (opțional):
- Folosește butonul "Copiază rezultate" pentru a copia toate calculele în clipboard-ul tău pentru caietul de laborator sau protocoale

Calculatorul efectuează verificări de validare pentru a se asigura că toate intrările sunt numere pozitive și că volumul total este suficient pentru volumele de ADN necesare. Dacă se detectează erori, mesaje de eroare utile te vor ghida să corectezi intrările.

Cazuri de Utilizare

Calculatorul de Ligation a ADN este valoros în numeroase aplicații de biologie moleculară:

Clonare Moleculară

Cazul cel mai comun de utilizare este clonarea moleculară standard, unde cercetătorii inseră gene sau fragmente de ADN în vectori plasmidici. Calculatorul asigură condiții optime pentru:

Subclonarea genelor între diferite vectori de expresie
Crearea proteinelor fuzionate prin unirea mai multor fragmente de gene
Construirea testelor cu gene reportere
Construirea bibliotecilor de plasmide

Biologia Sintetică

În biologia sintetică, unde sunt adesea asamblate mai multe fragmente de ADN:

Reacțiile de Gibson Assembly beneficiază de raporturi precise insert:vector
Sistemele de asamblare Golden Gate necesită concentrații specifice de ADN
Asamblarea BioBrick a părților genetice standardizate
Construirea circuitelor genetice sintetice

Dezvoltarea Kiturilor Diagnostice

Când se dezvoltă instrumente de diagnostic molecular:

Clonarea markerilor genetici specifici pentru boli
Construirea plasmidelor de control pozitiv
Dezvoltarea standardelor de calibrare pentru qPCR

Sisteme de Expresie a Proteinelor

Pentru cercetătorii care lucrează la producția de proteine:

Optimizarea raporturilor insert:vector pentru vectori de expresie cu copie mare
Construirea sistemelor de expresie inducibile
Crearea vectorilor de secreție pentru purificarea proteinelor

Aplicații CRISPR-Cas9

În aplicațiile de editare genomică:

Clonarea ARN-urilor ghid în vectori CRISPR
Crearea șabloanelor donatoare pentru repararea direcționată prin omologie
Construirea bibliotecilor de ARN-uri ghid pentru screening

Ligații Provocatoare

Calculatorul este deosebit de valoros pentru scenariile de ligare provocatoare:

Clonarea inserturilor mari (>5 kb)
Inserțiile de fragmente foarte mici (<100 bp)
Ligările cu capete plate care au o eficiență mai mică
Reacțiile de asamblare a mai multor fragmente

Alternative

În timp ce calculatorul nostru de Ligation a ADN oferă calcule precise pentru reacțiile de ligare tradiționale, există mai multe abordări alternative pentru unirea fragmentelor de ADN:

Gibson Assembly: Folosește exonuclează, polimerază și ligază într-o reacție într-un singur tub pentru a uni fragmentele de ADN care se suprapun. Nu este necesară calcularea tradițională a ligării, dar raporturile de concentrație sunt încă importante.
Golden Gate Assembly: Folosește enzimele de restricție de tip IIS pentru asamblarea direcțională, fără cicatrici, a mai multor fragmente. Necesită cantități echimolare de toate fragmentele.
SLIC (Clonare Independentă de Ligare și Secvență): Folosește exonuclează pentru a crea suprapunerile cu un singur fir care se anexează împreună. De obicei, folosește raporturi echimolare de fragmente.
In-Fusion Cloning: Sistem comercial care permite unirea fragmentelor cu suprapuneri de 15 bp. Folosește un raport specific bazat pe dimensiunile fragmentelor.
Gateway Cloning: Folosește recombinarea specifică a site-ului în loc de ligare. Necesită vectori de intrare și destinație specifici.
Testare Empirică: Unele laboratoare preferă să configureze mai multe reacții de ligare cu diferite raporturi insert:vector (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) și să determine care funcționează cel mai bine pentru construcțiile lor specifice.
Calculator Software: Pachetele software comerciale precum Vector NTI și SnapGene includ calculatoare de ligare cu caracteristici suplimentare, cum ar fi analiza site-urilor de restricție.

Istorie

Dezvoltarea calculilor de ligare ADN paralelează evoluția tehnicilor de clonare moleculară, care au revoluționat biologia moleculară și biotehnologia.

Primele Dezvoltări (1970)

Conceptul de ligare ADN pentru clonarea moleculară a apărut la începutul anilor 1970 cu lucrările de pionierat ale lui Paul Berg, Herbert Boyer și Stanley Cohen, care au dezvoltat primele molecule de ADN recombinant. În această perioadă, reacțiile de ligare erau în mare parte empirice, cercetătorii folosind încercări și erori pentru a determina condițiile optime.

Descoperirea enzimelor de restricție și a ligazei ADN a furnizat instrumentele esențiale pentru tăierea și reunirea moleculelor de ADN. Ligaza ADN T4, izolată din E. coli infectată cu bacteriofagul T4, a devenit enzima standard pentru unirea fragmentelor de ADN datorită capacității sale de a liga atât capetele plate, cât și cele coezive.

Perioada de Refinare (1980-1990)

Pe măsură ce clonarea moleculară a devenit mai obișnuită, cercetătorii au început să dezvolte abordări mai sistematice pentru reacțiile de ligare. Importanța raporturilor molare între ADN-ul vector și insert a devenit evidentă, ducând la dezvoltarea formulei de bază utilizate și astăzi.

În această perioadă, cercetătorii au stabilit că excesul de ADN insert (de obicei, un raport molar de 3:1 până la 5:1) îmbunătățește în general eficiența ligării pentru aplicațiile de clonare standard. Această cunoaștere a fost inițial împărtășită prin protocoale de laborator și a ajuns treptat în manualele și cărțile de biologie moleculară.

Era Modernă (2000-Prezent)

Apariția instrumentelor computaționale și a calculatoarelor online în anii 2000 a făcut calculele precise de ligare mai accesibile pentru cercetători. Pe măsură ce tehnicile de biologie moleculară au devenit mai sofisticate, necesitatea unor calcule precise a devenit mai critică, în special pentru proiectele de clonare provocatoare care implică mai multe fragmente sau inserturi mari.

Astăzi, calculele de ligare ADN sunt o parte integrantă a fluxurilor de lucru de clonare moleculară, cu calculatoare dedicate ca acesta ajutând cercetătorii să își optimizeze experimentele. Formula de bază a rămas în mare parte neschimbată, deși înțelegerea noastră a factorilor care afectează eficiența ligării s-a îmbunătățit.

Apariția metodelor alternative de clonare, cum ar fi Gibson Assembly și asamblarea Golden Gate, a introdus noi nevoi de calcul, dar conceptul fundamental al raporturilor molare între fragmentele de ADN rămâne important în cadrul acestor tehnici.

Exemple de Cod

Iată implementări ale calculatorului de ligation a ADN în diferite limbaje de programare:

1' Funcție Excel VBA pentru Calculatorul de Ligation a ADN
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Calculează cantitatea necesară de insert în ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Calculează volumul vector în μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Calculează volumul insert în μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Calculează volumul buffer/apă în μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Exemplu de utilizare într-o celulă:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Calculează volumele pentru o reacție de ligare ADN.
5    
6    Parametrii:
7    vector_concentration (float): Concentrarea ADN-ului vector în ng/μL
8    vector_length (float): Lungimea ADN-ului vector în baze
9    insert_concentration (float): Concentrarea ADN-ului insert în ng/μL
10    insert_length (float): Lungimea ADN-ului insert în baze
11    molar_ratio (float): Raportul molar dorit de insert:vector
12    total_volume (float): Volumul total al reacției în μL
13    vector_amount (float): Cantitatea de ADN vector de utilizat în ng (implicit: 50)
14    
15    Returnează:
16    dict: Dicționar care conține volumele și cantitățile calculate
17    """
18    # Calculează volumul vector
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Calculează cantitatea necesară de insert
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Calculează volumul insert
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Calculează volumul buffer/apă
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Exemplu de utilizare
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Convertește lungimile în kb pentru calcul
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Calculează cantitatea necesară de insert
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Calculează volumele
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Exemplu de utilizare
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Convertește lungimile în kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Calculează cantitatea necesară de insert
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Calculează volumele
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Rotunjeste la 2 zecimale
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Convertește lungimile în kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Calculează cantitatea necesară de insert
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Calculează volumele
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Rotunjeste la 2 zecimale
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Întrebări Frecvente (FAQ)

Care este raportul molar optim pentru ligarea ADN?

Raportul molar optim de insert la vector variază de obicei între 3:1 și 5:1 pentru aplicații standard de clonare. Cu toate acestea, acest lucru poate varia în funcție de scenariul specific de ligare:

Pentru ligările cu capete coezive: 1:1 până la 3:1
Pentru ligările cu capete plate: 3:1 până la 5:1
Pentru inserturi mari (>10 kb): 1:1 până la 2:1
Pentru inserturi mici (<500 bp): 5:1 până la 10:1
Pentru asamblarea mai multor fragmente: 3:1 pentru fiecare insert la vector

De ce reacția mea de ligare eșuează în ciuda utilizării volumelor calculate?

Mai mulți factori pot afecta eficiența ligării dincolo de raportul molar:

Calitatea ADN-ului: Asigură-te că atât vectorul, cât și insertul au capete curate, fără daune
Defozforilarea: Verifică dacă vectorul tău a fost defosforilat, ceea ce împiedică auto-ligarea
Activitatea enzimatică: Verifică dacă ligaza ta este activă și utilizată la temperatura corectă
Timpul de incubare: Unele ligări beneficiază de un timp de incubare mai lung (peste noapte la 16°C)
Condițiile bufferului: Asigură-te că se folosește bufferul corect cu ATP
Contaminanți: Purifică ADN-ul pentru a elimina inhibitori precum EDTA sau sare înaltă

Cât de mult ADN vector ar trebui să folosesc într-o reacție de ligare?

De obicei, se recomandă 50-100 ng de ADN vector pentru reacții standard de ligare. Utilizarea prea multor vectori poate duce la un fond mai mare de vector neîncercat sau auto-ligat, în timp ce prea puțin poate reduce eficiența transformării. Pentru ligări provocatoare, s-ar putea să fie necesar să optimizezi această cantitate.

Ar trebui să ajustez calculele pentru ligările cu capete plate în comparație cu cele cu capete coezive?

Da. Ligările cu capete plate sunt în general mai puțin eficiente decât ligările cu capete coezive. Pentru ligările cu capete plate, folosește:

Raporturi molare mai mari (3:1 până la 5:1 sau chiar mai mari)
Mai multă ligază ADN T4 (de obicei de 2-3 ori mai mult)
Timp de incubare mai lung
Ia în considerare adăugarea de PEG pentru a îmbunătăți eficiența ligării

Cum calculez ligarea pentru mai multe inserturi?

Pentru asamblarea mai multor fragmente:

Calculează fiecare cantitate de insert individual folosind aceeași formulă
Menține același raport molar total (de exemplu, pentru două inserturi, folosește 1.5:1.5:1 insert1:insert2:vector)
Ajustează volumul total al reacției pentru a acomoda toate fragmentele de ADN
Ia în considerare ligarea secvențială sau utilizarea metodelor de asamblare precum Gibson Assembly pentru mai multe fragmente

Pot folosi acest calculator pentru Gibson Assembly sau Golden Gate Assembly?

Acest calculator este conceput specific pentru clonarea bazată pe enzimele de restricție și ligază. Pentru Gibson Assembly, se recomandă cantități echimolare de toate fragmentele (raport 1:1), deși calculul de bază al cantității de ADN pe baza lungimii este similar. Pentru Golden Gate Assembly, se folosesc de asemenea raporturi echimolare ale tuturor componentelor.

Cum iau în considerare defosforilarea vectorului în calculele mele?

Defosforilarea vectorului (îndepărtarea grupelor de fosfat 5') împiedică auto-ligarea, dar nu schimbă calculele cantității. Cu toate acestea, pentru vectori defosforilați:

Folosește ADN insert proaspăt cu 5' fosfați intacți
Ia în considerare utilizarea unor raporturi insert:vector ușor mai mari (4:1 până la 6:1)
Asigură-te că timpul de ligare este mai lung (cel puțin 1 oră la temperatura camerei sau peste noapte la 16°C)

Care este volumul minim total al reacției pe care ar trebui să-l folosesc?

Volumul minim practic al reacției este de obicei de 10 μL, ceea ce permite amestecarea adecvată și previne problemele de evaporare. Dacă volumele tale calculate de ADN depășesc volumul dorit al reacției, ai mai multe opțiuni:

Folosește probe de ADN mai concentrate
Scade cantitatea de vector utilizată (de exemplu, 25 ng în loc de 50 ng)
Crește volumul total al reacției
Ia în considerare concentrarea probelor tale de ADN

Cât timp ar trebui să incub reacția mea de ligare?

Timpurile optime de incubare variază în funcție de tipul de ligare:

Ligările cu capete coezive: 1 oră la temperatura camerei (22-25°C) sau 4-16 ore la 16°C
Ligările cu capete plate: 2-4 ore la temperatura camerei sau peste noapte (12-16 ore) la 16°C
Ligările rapide (folosind ligază de înaltă concentrare): 5-15 minute la temperatura camerei

Pot reutiliza reacția de ligare rămasă pentru transformare?

Da, amestecurile de ligare pot fi de obicei stocate la -20°C și reutilizate pentru transformare. Cu toate acestea, fiecare ciclu de îngheț-dezgheț poate reduce eficiența. Pentru cele mai bune rezultate:

Alocă amestecul de ligare înainte de înghețare
Inactivează termic ligaza (65°C timp de 10 minute) înainte de stocare
Folosește în termen de 1-2 luni pentru rezultate optime

Referințe

Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647
Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069
Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852
Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/
New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202
Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html
Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/

Calculator de ligare a ADN-ului pentru experimente de clonare moleculară

Calculator de Ligation a ADN-ului

Parametrii de Intrare

Rezultatele Ligation

Documentație