Calculator ADN Ligație - Calculați Rapoartele Insert:Vector pentru Clonare Moleculară

Ligarea ADN-ului este etapa clonării moleculare în care un fragment de inserție este ligat la un vector plasmidic prin intermediul enzimei T4 ADN-ligază. Un calculator pentru ligarea ADN-ului determină câți microlitri de ADN inserat și de ADN vector trebuie amestecați pentru ca reacția să atingă un raport molar ales între inserție și vector.

Ce face calculatorul

Calculatorul necesită șase date de intrare: concentrația vectorului, lungimea vectorului, concentrația inserției, lungimea inserției, raportul molar țintă dintre inserție și vector și volumul total al reacției. De asemenea, permite utilizatorului să stabilească ce cantitate de ADN vector să folosească, valoarea implicită fiind de 50 nanograme (ng). Pe baza acestor valori, calculează volumul de vector de pipetat, volumul de inserție de pipetat și cantitatea de tampon sau apă care trebuie adăugată pentru a ajunge la volumul total al reacției.

Concentrația se măsoară în nanograme pe microlitru (ng/μL), de obicei citită cu un instrument Nanodrop sau Qubit. Lungimea se măsoară în perechi de baze (bp). Un kilobază (kb) este egală cu 1000 perechi de baze. Raportul molar descrie câte molecule de inserție trebuie să fie prezente pentru fiecare moleculă de vector. Nu este un raport de masă.

De ce se folosește raportul molar, nu masa

Mase egale de ADN nu conțin un număr egal de molecule. O inserție scurtă cântărește mai puțin decât un vector lung cu același număr de molecule. Amestecarea unor cantități egale, în nanograme, de inserție scurtă și vector lung ar lăsa mult prea puține molecule de inserție în raport cu moleculele de vector. Calculatorul ajustează masa inserției în funcție de raportul lungimilor fragmentelor, astfel încât amestecul final să conțină numărul dorit de molecule de inserție pentru fiecare moleculă de vector.

Formula pentru ligarea ADN-ului

Cantitatea necesară de ADN inserat, exprimată în nanograme, este:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

unde $m_i$ reprezintă cantitatea de inserție în nanograme, $m_v$ cantitatea de vector în nanograme, $k_i$ lungimea inserției în kilobaze, $k_v$ lungimea vectorului în kilobaze, iar R este raportul molar țintă dintre inserție și vector.

După determinarea acestei cantități, calculatorul convertește fiecare cantitate în volumul care poate fi pipetat:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

unde $V_v$ și $V_i$ reprezintă volumele vectorului și inserției în microlitri, $c_v$ și $c_i$ reprezintă concentrațiile vectorului și inserției în nanograme pe microlitru, $V_b$ este volumul tamponului, iar $V_t$ volumul total al reacției.

Dacă volumul vectorului și cel al inserției depășesc împreună volumul total al reacției, nu mai rămâne loc pentru tampon, ligază sau apă. În acest caz, calculatorul indică faptul că volumul total este prea mic, în loc să afișeze o cantitate negativă de tampon.

Exemplu de calcul

Un cercetător clonează un fragment genic de 1 kb într-un vector plasmidic de 3 kb. Planul este să folosească 50 ng de ADN vector la un raport molar inserție:vector de 3:1, într-o reacție de 20 μL.

Date de intrare:

• Concentrația vectorului: 50 ng/μL
• Lungimea vectorului: 3000 bp (3 kb)
• Concentrația inserției: 25 ng/μL
• Lungimea inserției: 1000 bp (1 kb)
• Raport molar: 3
• Volumul total: 20 μL
• Cantitatea de vector: 50 ng

Etapa 1: cantitatea de inserție

ng de inserție = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Etapa 2: volume

Volumul de vector = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Volumul de inserție = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Volumul de tampon = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reacția conține 1 μL de vector, 2 μL de inserție și 17 μL de tampon sau apă, în care se adaugă și ligaza împreună cu tamponul său de reacție. Acest amestec oferă trei molecule de inserție pentru fiecare moleculă de vector.

Raporturi molare tipice pentru ligare

În majoritatea clonărilor standard cu capete coezive și prelungiri terminale se folosește un raport inserție:vector de 3:1. Ligările între capete boante sunt mai puțin eficiente, astfel că este frecvent utilizat un raport mai mare, precum 5:1. Inserțiile foarte mari funcționează uneori mai bine cu un raport mai mic, apropiat de 1:1, deoarece fragmentele mari contribuie deja cu multe perechi de baze pe moleculă.

Întrebări frecvente

Ce este ligarea ADN-ului?

Ligarea ADN-ului este unirea a două fragmente de ADN, de obicei un vector plasmidic și o inserție, într-o singură moleculă continuă. Enzima T4 ADN-ligază sigilează legătura dintre capetele fragmentelor.

Ce înseamnă raportul molar inserție:vector?

Acesta reprezintă numărul de molecule de ADN inserat prezente pentru fiecare moleculă de vector din reacție. Un raport de 3:1 înseamnă trei molecule de inserție pentru fiecare moleculă de vector, indiferent de raportul dintre masele lor.

De ce nu se folosesc cantități egale, în nanograme, de vector și inserție?

Fragmentele de ADN cu lungimi diferite au mase diferite per moleculă. O inserție de 1 kb cântărește aproximativ o treime din cât cântărește un vector de 3 kb, moleculă pentru moleculă. Cantități egale în nanograme din fiecare nu ar oferi un număr egal de molecule, astfel că calculatorul ajustează masa inserției pentru a corespunde raportului molar țintă.

Ce înseamnă dacă volumul total este prea mic?

Înseamnă că numai volumele vectorului și inserției consumă deja întregul volum al reacției, fără să mai rămână loc pentru tampon sau ligază. Soluția este creșterea volumului total al reacției sau utilizarea unor soluții stoc de ADN mai concentrate.

Poate fi folosit acest calculator pentru clonarea prin Gibson Assembly sau Golden Gate?

Nu. Aceste metode folosesc o chimie de reacție diferită și urmăresc de obicei cantități echimolare ale tuturor fragmentelor, nu un raport inserție:vector fix. Calculele de volum diferă de cele pentru clonarea standard cu T4 ADN-ligază.

Cât ADN vector se folosește de obicei?

50 ng este o cantitate inițială obișnuită pentru o reacție standard de ligare. Laboratoarele folosesc și cantități cuprinse între 25 și 100 ng, ajustate în funcție de concentrația ADN-ului și de volumul reacției.