Calculați concentrația ADN din citirile de absorbție (A260) cu factori de diluție ajustabili. Instrument esențial pentru laboratoarele de biologie moleculară și cercetarea genetică.
Concentrația ADN este calculată folosind următoarea formulă:
Un calculator de concentrare ADN este un instrument online esențial care ajută biologi moleculare, geneticieni și tehnicieni de laborator să determine cu precizie concentrația ADN-ului din citirile spectrofotometrice. Acest calculator gratuit folosește metoda standard A260 pentru a converti măsurătorile de absorbție UV în valori precise ale concentrației ADN în ng/μL.
Măsurarea concentrației ADN este o procedură fundamentală în laboratoarele de biologie moleculară, servind ca un pas critic de control al calității înainte de PCR, secvențiere, clonare și alte tehnici moleculare. Calculatorul nostru elimină calculele manuale și reduce erorile atunci când se determină atât concentrația, cât și cantitățile totale de ADN din probele dumneavoastră.
Calculul concentrației ADN se bazează pe Legea Beer-Lambert, care afirmă că absorbția unei soluții este direct proporțională cu concentrația speciilor absorbante din soluție și lungimea căii luminii prin soluție. Pentru ADN cu două fire, o absorbție de 1.0 la 260nm (A260) într-o cuvetă cu lungimea căii de 1cm corespunde unei concentrații de aproximativ 50 ng/μL.
Concentrația ADN este calculată folosind următoarea formulă:
Unde:
Cantitatea totală de ADN din probă poate fi apoi calculată prin:
Absorbția la 260nm (A260):
Factorul de Conversie (50):
Factorul de Dilutie:
Volumul:
Urmați acest proces simplu pentru a calcula concentrația ADN din citirile dumneavoastră A260:
Măsurarea concentrației ADN este esențială pentru numeroase aplicații de biologie moleculară și cercetare:
Înainte de a ligata fragmentele de ADN în vectori, cunoașterea concentrației exacte permite cercetătorilor să calculeze raportul optim inserție-vector, maximizând eficiența transformării. De exemplu, un raport molar de 3:1 între inserție și vector oferă adesea cele mai bune rezultate, ceea ce necesită măsurători precise ale concentrației ambelor componente.
Reacțiile PCR necesită de obicei 1-10 ng de ADN template pentru amplificare optimă. Prea puțin ADN poate duce la eșecul amplificării, în timp ce prea mult poate inhiba reacția. Pentru PCR cantitativ (qPCR), este necesară o cuantificare și mai precisă a ADN-ului pentru a asigura curbe standard exacte și cuantificare fiabilă.
Protocolele de preparare a bibliotecilor NGS specifică cantități exacte de ADN de intrare, adesea în intervalul de 1-500 ng, în funcție de platformă și aplicație. Măsurarea precisă a concentrației este esențială pentru o pregătire de bibliotecă de succes și o reprezentare echilibrată a probelor în runde de secvențiere multiplexate.
Când se introduce ADN în celule eucariote, cantitatea optimă de ADN variază în funcție de tipul de celulă și metoda de transfecție. De obicei, se folosesc 0.5-5 μg de ADN plasmidic pe fiecare puț pentru un format de plăci cu 6 puțuri, necesitând măsurători precise ale concentrației pentru a standardiza experimentele.
În aplicațiile de medicină legală, probele de ADN sunt adesea limitate și prețioase. Cuantificarea precisă permite oamenilor de știință din domeniul criminalisticii să determine dacă ADN-ul este suficient pentru profilare și să standardizeze cantitatea de ADN utilizată în analizele ulterioare.
Enzimele de restricție au unități de activitate specifice definite pe μg de ADN. Cunoașterea concentrației exacte de ADN permite raporturi corecte între enzimă și ADN, asigurând o digestie completă fără activitate de tip star (tăiere nespecifică).
Deși spectrofotometria UV este cea mai comună metodă pentru cuantificarea ADN-ului, există mai multe alternative:
Metode Fluorometrice:
Electroforeza în Gel de Agaroză:
PCR în Timp Real:
PCR Digital:
Capacitatea de a măsura cu precizie concentrația ADN a evoluat semnificativ odată cu progresele în biologia moleculară:
După descoperirea structurii ADN-ului de către Watson și Crick în 1953, oamenii de știință au început să dezvolte metode pentru a izola și cuantifica ADN-ul. Abordările timpurii s-au bazat pe teste colorimetrice, cum ar fi reacția cu diphenylamine, care producea o culoare albastră atunci când reacționa cu zaharurile deoxiriboză din ADN. Aceste metode erau relativ insensibile și predispuse la interferențe.
Aplicarea spectrofotometriei UV pentru cuantificarea acizilor nucleici a devenit răspândită în anii 1970. Oamenii de știință au descoperit că ADN-ul absoarbe lumina UV cu un maxim la 260nm și că relația dintre absorbție și concentrație era liniară într-un anumit interval. Factorul de conversie de 50 ng/μL pentru ADN cu două fire la A260 = 1.0 a fost stabilit în această perioadă.
Dezvoltarea coloranților fluorescenți specifici ADN-ului în anii 1980 și 1990 a revoluționat cuantificarea ADN-ului, în special pentru probele diluate. Coloranții Hoechst și ulterior PicoGreen au permis o detectare mult mai sensibilă decât era posibilă cu spectrofotometria. Aceste metode au devenit deosebit de importante odată cu apariția PCR, care necesita adesea cuantificarea precisă a cantităților minime de ADN.
Introducerea spectrofotometrelor microvolume precum NanoDrop la începutul anilor 2000 a transformat cuantificarea de rutină a ADN-ului, necesitând doar 0.5-2 μL de probă. Această tehnologie a eliminat necesitatea diluțiilor și a cuvetelor, făcând procesul mai rapid și mai convenabil.
Astăzi, tehnici avansate precum PCR digital și secvențierea de generație următoare au împins limitele cuantificării ADN-ului și mai departe, permițând cuantificarea absolută a secvențelor specifice și detectarea moleculelor unice. Cu toate acestea, principiul spectrofotometric de bază stabilit cu decenii în urmă rămâne fundamentul măsurării de rutină a concentrației ADN în laboratoarele din întreaga lume.
Să parcurgem câteva exemple practice de calcul al concentrației ADN:
Un cercetător a purificat un plasmid și a obținut următoarele măsurători:
Calcul:
După extragerea ADN-ului genomic din sânge:
Calcul:
Un protocol de secvențiere necesită exact 500 ng de ADN:
Volumul necesar = 500 ÷ 125 = 4 μL de soluție de ADN
Iată exemple de cum să calculați concentrația ADN în diferite limbaje de programare:
1' Formula Excel pentru concentrația ADN
2=A260*50*FactorulDeDilutie
3
4' Formula Excel pentru cantitatea totală de ADN în μg
5=(A260*50*FactorulDeDilutie*Volumul)/1000
6
7' Exemplu într-o celulă cu A260=0.5, FactorulDeDilutie=2, Volumul=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Rezultatul: 5 μg
101def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2 """
3 Calculează concentrația ADN în ng/μL
4
5 Parametrii:
6 absorbance (float): Citirea absorbției la 260nm
7 dilution_factor (float): Factorul de diluție al probei
8
9 Returnează:
10 float: Concentrația ADN în ng/μL
11 """
12 return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15 """
16 Calculează cantitatea totală de ADN în μg
17
18 Parametrii:
19 concentration (float): Concentrația ADN în ng/μL
20 volume_ul (float): Volumul soluției de ADN în μL
21
22 Returnează:
23 float: Cantitatea totală de ADN în μg
24 """
25 return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Exemplu de utilizare
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"Concentrația ADN: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"Total ADN: {total_dna:.2f} μg")
37function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) { // Returnează concentrația ADN în ng/μL return absorbance * 50 * dilutionFactor; } function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) { // Returnează cantitatea totală de ADN în μg return (concentration * volumeUL) / 1000; } // Exemplu de utilizare const absorbance = 0.65; const dilutionFactor = 2; const volume = 100; const concentration = calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor); const totalDNA = calculateTotalDNA(concentration, volume); console.log(`
Descoperiți mai multe instrumente care ar putea fi utile pentru fluxul dvs. de lucru