Calculator Concentrație ADN | Convertor A260 la ng/μL

Calculator pentru concentrația ADN-ului

Un calculator pentru concentrația ADN-ului transformă o valoare a absorbanței UV măsurată la 260 nanometri, numită A260, în concentrația ADN-ului exprimată în nanograme pe microlitru (ng/µL). De asemenea, raportează cantitatea totală de ADN dintr-o probă, în micrograme (µg).

Ce este absorbanța A260?

A260 reprezintă cantitatea de lumină ultravioletă absorbită de o soluție la o lungime de undă de 260 nanometri. ADN-ul absoarbe cel mai intens lumina UV în apropierea acestei lungimi de undă datorită bazelor sale nucleotidice. Un spectrofotometru măsoară A260 după efectuarea unei citiri de alb, folosind același tampon ca pentru probă, pentru a elimina absorbanța de fond. Cu cât soluția conține mai mult ADN, cu atât valoarea A260 este mai mare.

Formula concentrației ADN-ului

ADN-ul bicatenar absoarbe lumina UV proporțional cu concentrația sa, relație cunoscută drept legea Beer-Lambert. Pe un traseu optic standard de 1 centimetru, o soluție cu o valoare A260 de 1,0 conține aproximativ 50 ng/µL de ADN bicatenar. Acest număr, factorul de conversie, transformă orice valoare A260 într-o concentrație:

Concentrația ADN-ului (ng/µL) = A260 × 50 × factorul de diluție

Factorul de diluție ține cont de orice diluare efectuată înainte de măsurarea probei. O probă măsurată fără diluare are un factor de diluție de 1.

Cum se calculează cantitatea totală de ADN

După determinarea concentrației, masa totală de ADN din probă poate fi calculată pe baza volumului acesteia:

Cantitatea totală de ADN (µg) = concentrația (ng/µL) × volumul (µL) ÷ 1000

Cum se calculează concentrația ADN-ului: pas cu pas

1. Amestecați bine proba înainte de măsurare. ADN-ul se poate lipi de pereții tubului sau se poate depune neuniform.
2. Diluați proba dacă este foarte concentrată, urmărind obținerea unei valori A260 între 0,1 și 1,0. Citirile spectrofotometrului sunt cel mai puțin fiabile în afara acestui interval.
3. Efectuați citirea de alb a spectrofotometrului cu același tampon folosit pentru diluare, apoi măsurați proba la 260 nm.
4. Introduceți valoarea A260, volumul probei și factorul de diluție în calculator pentru a obține concentrația și cantitatea totală. Toate cele trei câmpuri trebuie completate, iar volumul trebuie să fie mai mare decât zero înainte de afișarea unui rezultat.

Exemplu de calcul

Exemplul 1: probă nediluată

O valoare A260 de 0,5, fără diluare (factor de diluție 1) și un volum al probei de 100 µL.

• Concentrație = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Cantitate totală de ADN = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Exemplul 2: probă diluată

Un tub conține 50 µL de ADN purificat. O mică parte din acesta a fost diluată de 10 ori, iar porțiunea diluată a avut o valoare A260 de 0,75. Factorul de diluție transformă această valoare înapoi în concentrația din tubul original, iar 50 µL este volumul introdus pentru calcularea cantității totale.

• Concentrație = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Cantitate totală de ADN = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Calcularea factorului de diluție

Factorul de diluție = volumul total după diluare ÷ volumul probei originale.

Adăugarea a 5 µL de soluție de ADN la 45 µL de tampon produce un volum total de 50 µL, astfel încât factorul de diluție este 50 ÷ 5 = 10. O probă care nu a fost diluată are un factor de diluție de 1.

Intervalele tipice ale concentrației ADN-ului

Concentrația depinde de tipul probei și de metoda de extracție. Extracțiile de ADN genomic se încadrează de obicei între aproximativ 10 și 100 ng/µL. Preparatele de ADN plasmidic au adesea concentrații mai mari, uneori de câteva sute de ng/µL. Un rezultat mult în afara intervalului așteptat pentru o anumită metodă poate indica o problemă la extracție sau chiar la măsurare.

Limitele măsurării absorbanței UV

Măsurarea A260 este rapidă, dar nu este cea mai sensibilă sau specifică metodă pentru ADN. Proteinele, ARN-ul și unele componente ale tamponului absorb, de asemenea, lumina în apropierea valorii 260 nm și pot crește artificial valoarea măsurată. Pentru a depista contaminarea cu proteine, cercetătorii verifică adesea raportul A260/A280 împreună cu concentrația; un raport apropiat de 1,8 indică de obicei o probă de ADN pură. Metodele bazate pe coloranți fluorescenți, precum testele Qubit, se leagă doar de ADN-ul bicatenar și oferă o valoare mai exactă pentru probele diluate sau impurificate, deși necesită reactivi suplimentari și un fluorometru.

Întrebări frecvente

Cum se calculează concentrația ADN-ului din A260?

Înmulțiți valoarea A260 cu 50, factorul standard de conversie pentru ADN-ul bicatenar, apoi înmulțiți cu factorul de diluție. Dacă proba nu a fost diluată, utilizați un factor de diluție de 1.

Care este un raport A260/A280 bun?

Un raport apropiat de 1,8 indică de obicei o probă de ADN pură. Un raport mai mic sugerează contaminarea cu proteine. Un raport mai mare de 2,0 poate indica contaminarea cu ARN.

Poate fi folosit acest calculator pentru ARN?

Nu direct, deoarece pentru ARN se utilizează un factor de conversie de 40 ng/µL în loc de 50. Pentru a estima concentrația ARN-ului, înmulțiți rezultatul calculatorului cu 0,8 (40 ÷ 50) sau utilizați direct A260 × 40 × factorul de diluție.

De ce trebuie ca valoarea A260 să fie cuprinsă între 0,1 și 1,0?

Absorbanța rămâne aproximativ proporțională cu concentrația, conform legii Beer-Lambert, în principal în acest interval. În afara lui, citirile devin mai puțin fiabile, astfel încât o probă prea concentrată sau prea diluată trebuie diluată sau concentrată înainte de a fi măsurată din nou.

Care este diferența dintre concentrație și puritate?

Concentrația măsoară cantitatea de ADN prezentă, în ng/µL. Puritatea măsoară cât de curată este proba, fiind evaluată în principal pe baza unor rapoarte de absorbanță precum A260/A280. O probă poate avea o concentrație mare și totuși să fie impură sau poate avea o concentrație mică și să fie foarte pură.

Cum convertesc ng/µL în µg/mL?

Cele două unități sunt egale numeric. 1 ng/µL este egal cu 1 µg/mL, deoarece atât unitatea de masă, cât și unitatea de volum se modifică cu un factor de 1000.

Referințe

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ediția a 3-a). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Cuantificarea ADN-ului și ARN-ului prin spectroscopie de absorbție și fluorescență. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Valoarea rapoartelor A260/A280 pentru măsurarea purității acizilor nucleici. BioTechniques, 19(2), 208–210.