Calculator Volum Probă BCA | Instrument de Cuantificare Proteică

Ce este un calculator al volumului probei pentru BCA

Un calculator al volumului probei pentru BCA transformă citirea absorbanței obținută la testul proteic BCA în volumul probei, în microlitri (μL), necesar pentru încărcarea unei cantități țintă de proteină. Este utilizat după efectuarea unui test proteic cu acid bicinconinic (BCA), o analiză de laborator obișnuită care măsoară cantitatea de proteină dintr-o soluție prin determinarea intensității culorii purpurii absorbante de lumină pe care o dezvoltă proba.

Cum măsoară testul BCA cantitatea de proteină

Testul BCA se desfășoară în două etape. Mai întâi, proteina din probă reduce ionii de cupru (Cu²⁺) la o altă formă (Cu¹⁺) într-o soluție alcalină. Gradul reducerii depinde de cantitatea de proteină prezentă. Apoi, acidul bicinconinic leagă cuprul redus și formează un compus purpuriu care absoarbe puternic lumina la lungimea de undă de 562 nanometri (nm).

Un spectrofotometru măsoară cantitatea de lumină absorbită de probă la 562 nm. Această valoare se numește absorbanță. O culoare purpurie mai închisă înseamnă o absorbanță mai mare și o cantitate mai mare de proteină. Laboratorul compară absorbanța fiecărei probe cu o curbă standard, construită prin măsurarea unor concentrații cunoscute ale unei proteine de referință, de obicei albumina serică bovină (BSA).

BCA este popular deoarece funcționează și atunci când proba conține detergenți precum SDS sau Triton X-100, substanțe chimice obișnuite în tampoanele de liză celulară, dar care compromit două analize mai vechi, metodele Bradford și Lowry.

Formula pentru transformarea absorbanței BCA în volumul probei

O curbă standard BCA este o dreaptă ajustată care exprimă absorbanța în funcție de concentrație:

$\text{Absorbanță} = \text{Pantă} \times \text{Concentrație} + \text{Interceptă}$

Pentru a face conversia inversă, de la absorbanța măsurată la concentrația de proteină, ecuația se inversează:

$\text{Concentrația proteinei (μg/μL)} = \frac{\text{Absorbanță} - \text{Interceptă}}{\text{Pantă}}$

După determinarea concentrației, volumul probei care conține o masă țintă de proteină este:

$\text{Volumul probei (μL)} = \frac{\text{Masa probei (μg)}}{\text{Concentrația proteinei (μg/μL)}}$

Calculatorul oferă patru tipuri de curbe presetate, fiecare cu propria pantă și ordonată la origine. Ordonata la origine este 0 în fiecare presetare, deoarece valorile sunt corectate față de martor (absorbanța unui control fără proteină este scăzută mai întâi). Panta indică proporția din intervalul de absorbanță al plăcii care este acoperită de intervalul de lucru al fiecărui protocol.

Un protocol mai sensibil, conceput pentru probe diluate, produce o absorbanță mai mare pentru fiecare microgram de proteină și, prin urmare, are o pantă mai mare. BCA îmbunătățit și Micro BCA sunt destinate probelor prea diluate pentru a fi măsurate cu precizie prin protocolul standard.

Cum se calculează volumul probei din absorbanța BCA

1. Efectuați testul BCA și citiți absorbanța la 562 nm pentru fiecare probă.
2. Alegeți tipul de curbă care corespunde protocolului utilizat (Standard, Enhanced sau Micro) sau introduceți panta și intercepta personalizate ale unei curbe generate în ziua respectivă.
3. Introduceți valoarea absorbanței și masa țintă de proteină, în micrograme, pentru fiecare probă.
4. Calculatorul transformă absorbanța în concentrația de proteină, apoi împarte masa țintă la această concentrație pentru a obține volumul de pipetat.

Exemplu: calcularea volumului probei din absorbanța BCA

Un cercetător care pregătește un western blot are nevoie de 20 μg de proteină pe bandă și utilizează curba BCA standard (pantă 1,0, interceptă 0).

Proba A are o absorbanță de 0,75:

• Concentrația proteinei = (0,75 − 0) / 1,0 = 0,75 μg/μL
• Volumul probei = 20 μg ÷ 0,75 μg/μL = 26,67 μL

Proba B are o absorbanță de 1,2:

• Concentrația proteinei = (1,2 − 0) / 1,0 = 1,2 μg/μL
• Volumul probei = 20 μg ÷ 1,2 μg/μL = 16,67 μL

Proba A este mai diluată, astfel că este necesar un volum mai mare pentru a atinge aceeași cantitate țintă de 20 μg.

Interpretarea rezultatelor calculatorului

Calculatorul raportează două valori pentru fiecare probă: concentrația proteinei, în μg/μL, și volumul probei, în μL. De asemenea, semnalează rezultatele care pot cauza probleme:

• O absorbanță mai mare de 3,0 declanșează un avertisment, deoarece valorile tipice BCA se situează între 0 și 2,0.
• O absorbanță mai mică de 0,05, dar mai mare decât zero, declanșează un avertisment că rezultatul poate fi mai puțin precis, deoarece semnalul scăzut este mai sensibil la zgomotul de măsurare.
• Un volum calculat de 1000 μL sau mai mare declanșează un avertisment de utilizare a unei probe mai concentrate.
• Un volum calculat mai mic de 0,5 μL declanșează un avertisment că volumul poate fi dificil de pipetat cu precizie.
• Absorbanța negativă sau masa negativă a probei este respinsă automat.

Utilizări practice în laborator

Încărcarea uniformă a proteinelor este una dintre cele mai frecvente surse de eșec în cazul unui western blot: intensitatea neuniformă a benzilor de pe piste reflectă adesea încărcarea inegală a proteinelor, nu diferențe reale de expresie. Calcularea unui volum exact pentru fiecare probă, pe baza propriei valori a absorbanței, menține încărcarea uniformă pe tot gelul.

Același calcul se aplică analizelor enzimatice, în care compararea activității între condiții necesită pornirea de la aceeași cantitate totală de proteină, și imunoprecipitării, în care cantități inegale de proteină introduse, de exemplu 800 μg într-un tub față de 1200 μg în altul, fac rezultatele dificil de comparat. În timpul purificării proteinelor, aceeași formulă este utilizată la fiecare etapă pentru a urmări câtă proteină rămâne în fiecare fracție.

Comparație cu alte teste pentru proteine

Scurt istoric al cuantificării proteinelor

Primele metode de măsurare a proteinelor s-au bazat pe metoda Kjeldahl (1883), care măsura conținutul de azot după digerarea probei în acid. Testul biuret, dezvoltat la începutul anilor 1900, utiliza o reacție de culoare între legăturile peptidice și ionii de cupru, dar nu era foarte sensibil. Oliver Lowry a combinat reacția biuret cu un reactiv suplimentar în 1951, creând metoda Lowry, care a dominat măsurarea proteinelor timp de decenii, deși era perturbată de substanțe chimice obișnuite de laborator, precum detergenții și EDTA. Marion Bradford a introdus o metodă mai rapidă, bazată pe legarea unui colorant, în 1976, dar și aceasta era compromisă în prezența detergenților și varia în funcție de conținutul de aminoacizi al proteinei. Paul Smith și colegii săi de la Pierce Chemical Company au publicat metoda BCA în 1985, combinând reacția biuret cu sensibilitatea mai mare a acidului bicinconinic față de cupru și obținând o analiză care tolerează detergenții prezenți în lizatele celulare obișnuite.

Exemplu de cod

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

Întrebări frecvente

La ce se folosește testul BCA? Măsoară concentrația totală de proteine dintr-o soluție, cel mai adesea înainte de încărcarea unor cantități egale de proteină pentru un western blot, înainte de normalizarea analizelor activității enzimatice sau în timpul urmăririi randamentului purificării proteinelor.

Cât de precis este testul BCA? În condiții bune, rezultatele sunt de obicei precise în limita a 5–10%, cu condiția ca această curbă standard să aibă cel puțin cinci sau șase puncte, iar proba să nu conțină o concentrație mare de substanțe interferente.

Ce interferează cu rezultatele testului BCA? Agenții reducători, inclusiv DTT și β-mercaptoetanolul, cresc artificial absorbanța deoarece reduc singuri cuprul, independent de proteină. Agenții chelatori, precum EDTA, scad absorbanța prin legarea cuprului înainte ca acesta să poată reacționa.

Care este diferența dintre testele BCA și Bradford? Bradford oferă un rezultat în aproximativ cinci minute, dar este perturbat de detergenți și reacționează diferit în funcție de compoziția de aminoacizi a unei proteine. BCA durează aproximativ 30 de minute, dar tolerează detergenții și oferă valori mai uniforme pentru proteine diferite, ceea ce îl face alegerea mai potrivită pentru lizatele celulare.

De ce este volumul calculat al probei neobișnuit de mare? Un volum mare înseamnă că concentrația măsurată a proteinelor este mai mică decât era de așteptat. Printre cauzele frecvente se numără liza celulară incompletă, diluarea excesivă a probei sau o valoare a absorbanței apropiată de limita inferioară de detecție a testului. Concentrarea probei folosind un dispozitiv de filtrare centrifugală sau trecerea la protocolul BCA îmbunătățit ori Micro BCA rezolvă de obicei problema.

Ce trebuie făcut dacă absorbanța se află în afara intervalului liniar? Diluați proba și măsurați din nou. Relația dintre absorbanță și concentrație se abate de la liniaritate peste aproximativ 2,0, astfel încât extrapolarea dincolo de curba standard subestimează concentrația reală.

Referințe

1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT și colab. „Measurement of protein using bicinchoninic acid.” Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85.
2. Thermo Fisher Scientific. „Pierce BCA Protein Assay Kit”, ghid de utilizare (MAN0011430).
3. Bradford MM. „A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein.” Analytical Biochemistry. 1976;72(1-2):248-254.