Calculați volumele precise ale probelor pe baza citirilor de absorbție ale testului BCA și a masei dorite de proteină. Esențial pentru încărcarea consistentă a proteinelor în bloturi western și alte aplicații de laborator.
Acest instrument calculează volumul necesar al probei pe baza rezultatelor de absorbție BCA și a masei probei. Introduceți valoarea absorbției și masa probei pentru fiecare probă pentru a calcula volumul corespunzător al probei.
Volumul probei este calculat folosind următoarea formulă:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
Calculatorul de Volum de Proba pe Baza de Absorbție BCA este un instrument specializat conceput pentru a ajuta cercetătorii și tehnicienii de laborator să determine cu acuratețe volumul de probă adecvat pentru experimente, pe baza rezultatelor testului BCA (acid bicinchoninic). Acest calculator preia citirile de absorbție din testul BCA și masa dorită a probei pentru a calcula volumul precis necesar pentru încărcarea consistentă a proteinelor în aplicații precum blotting-ul western, teste enzimatice și alte tehnici de analiză a proteinelor.
Testul BCA este una dintre cele mai utilizate metode pentru cuantificarea proteinelor în laboratoarele de biochimie și biologie moleculară. Măsurând absorbția probelor de proteină și comparându-le cu o curbă standard, puteți determina concentrația proteinelor cu o mare acuratețe. Calculatorul nostru simplifică acest proces prin convertirea automată a citirilor de absorbție în volumele exacte necesare pentru experimentele dumneavoastră.
Testul Bicinchoninic Acid (BCA) este un test biochimic pentru determinarea concentrației totale de proteină într-o soluție. Principiul acestui test se bazează pe formarea unui complex Cu²⁺-proteină în condiții alcaline, urmată de reducerea Cu²⁺ la Cu¹⁺. Cantitatea de reducere este proporțională cu proteina prezentă. BCA formează un complex de culoare violet cu Cu¹⁺ în medii alcaline, oferind o bază pentru a monitoriza reducerea cuprului de către proteine.
Intensitatea culorii violet crește proporțional cu concentrația de proteină, care poate fi măsurată utilizând un spectrofotometru la aproximativ 562 nm. Citirile de absorbție sunt apoi comparate cu o curbă standard pentru a determina concentrația de proteină în probele necunoscute.
Formula fundamentală pentru calcularea volumului de probă din rezultatele de absorbție BCA este:
Unde:
Concentrația de proteină este calculată din citirea de absorbție folosind ecuația curbei standard:
Pentru un test BCA standard, panta tipică este de aproximativ 2.0, iar interceptul este adesea aproape de zero, deși aceste valori pot varia în funcție de condițiile specifice ale testului și de curba standard.
Calculatorul nostru simplifică procesul de determinare a volumelor de probă din rezultatele testului BCA. Urmați acești pași pentru a obține calcule precise:
Introduceți Informațiile despre Probă:
Selectați Tipul de Curbă Standard:
Vizualizați Rezultatele:
Copiați sau Exportați Rezultatele:
Să parcurgem un exemplu practic:
Aceasta înseamnă că ar trebui să încărcați 13.33 μL din proba dumneavoastră pentru a obține 20 μg de proteină.
Calculatorul oferă mai multe informații importante:
Concentrația Proteinelor: Aceasta este calculată din citirea de absorbție folosind curba standard selectată. Reprezintă cantitatea de proteină pe unitate de volum în proba dumneavoastră (μg/μL).
Volumul Probe: Acesta este volumul probei dumneavoastră care conține cantitatea dorită de proteină. Această valoare este ceea ce veți folosi atunci când pregătiți experimentele dumneavoastră.
Avertizări și Recomandări: Calculatorul poate oferi avertizări pentru:
Una dintre cele mai comune aplicații pentru acest calculator este pregătirea probelor pentru blotting-ul western. Încărcarea consistentă a proteinelor este crucială pentru rezultate fiabile ale blotting-ului western, iar acest calculator asigură că încărcați aceeași cantitate de proteină pentru fiecare probă, chiar și atunci când concentrațiile lor diferă.
Flux de lucru exemplu:
Pentru teste enzimatice, este adesea necesar să folosiți o cantitate specifică de proteină pentru a standardiza condițiile de reacție între diferite probe sau experimente.
Flux de lucru exemplu:
În experimentele de imunoprecipitare (IP), începerea cu o cantitate consistentă de proteină este importantă pentru compararea rezultatelor între diferite condiții.
Flux de lucru exemplu:
În timpul purificării proteinelor, este adesea necesar să urmăriți concentrația de proteină și să calculați randamentele în diferite etape.
Flux de lucru exemplu:
Deși calculatorul oferă parametrii prestabiliți pentru testele standard BCA, puteți introduce și valori personalizate dacă ați generat propria curbă standard. Acest lucru este deosebit de util atunci când:
Pentru a utiliza o curbă standard personalizată:
Calculatorul permite adăugarea mai multor probe și calcularea volumelor lor simultan. Acest lucru este deosebit de util atunci când pregătiți probe pentru experimente care necesită încărcarea consistentă a proteinelor între diferite condiții.
Beneficiile procesării în lot:
Dacă citirea dumneavoastră de absorbție este peste 2.0, aceasta poate fi în afara intervalului liniar al testului BCA. În astfel de cazuri:
Pentru citirile de absorbție sub 0.1, este posibil să fiți aproape de limita de detecție a testului, ceea ce ar putea afecta acuratețea. Considerați:
Dacă calculatorul sugerează un volum care este prea mare pentru aplicația dumneavoastră:
Cuantificarea precisă a proteinelor a fost o cerință fundamentală în biochimie și biologie moleculară de la apariția acestor domenii. Metodele timpurii s-au bazat pe determinarea conținutului de azot, care era consumatoare de timp și necesita echipamente specializate.
Metoda Kjeldahl (1883): Una dintre cele mai timpurii metode pentru cuantificarea proteinelor, bazată pe măsurarea conținutului de azot.
Testul Biuret (Începutul anilor 1900): Această metodă se bazează pe reacția dintre legăturile peptide și ionii de cupru într-o soluție alcalină, producând o culoare violet.
Testul Lowry (1951): Dezvoltat de Oliver Lowry, această metodă a combinat reacția Biuret cu reactivul Folin-Ciocalteu, crescând sensibilitatea.
Testul Bradford (1976): Marion Bradford a dezvoltat această metodă folosind colorantul Coomassie Brilliant Blue G-250, care se leagă de proteine și schimbă maximul de absorbție.
Testul BCA (1985): Dezvoltat de Paul Smith și colegii săi de la Pierce Chemical Company, această metodă a combinat reacția biuret cu detecția BCA, oferind o sensibilitate îmbunătățită și compatibilitate cu detergenții.
Testul BCA a fost descris pentru prima dată într-un articol din 1985 de Smith et al. intitulat "Measurement of protein using bicinchoninic acid." A fost dezvoltat pentru a aborda limitările metodelor existente, în special interferența din partea diverselor substanțe chimice utilizate frecvent în extracția și purificarea proteinelor.
Inovația cheie a fost utilizarea acidului bicinchoninic pentru a detecta ionii Cu¹⁺ produși prin reducerea Cu²⁺ mediată de proteine, formând un complex de culoare violet care putea fi măsurat spectrofotometric. Acest lucru a oferit mai multe avantaje:
De la introducerea sa, testul BCA a devenit una dintre cele mai utilizate metode de cuantificare a proteinelor în laboratoarele de biochimie și biologie moleculară din întreaga lume.
1=IF(B2<=0,"Eroare: Absorbție invalidă",IF(C2<=0,"Eroare: Masă de probă invalidă",C2/(2*B2)))
2
3' Unde:
4' B2 conține citirea de absorbție
5' C2 conține masa dorită a probei în μg
6' Formula returnează volumul necesar al probei în μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Calculați concentrația de proteină din absorbție folosind curba standard."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbția nu poate fi negativă")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Calculați volumul necesar al probei pe baza absorbției și masei dorite."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Masa probei trebuie să fie pozitivă")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Concentrația de proteină calculată trebuie să fie pozitivă")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Exemplu de utilizare
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Pentru absorbția {absorbance} și masa dorită de proteină {sample_mass} μg:")
31 print(f"Concentrația de proteină: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Volumul necesar al probei: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Eroare: {e}")
351# Funcție pentru a calcula concentrația de proteină din absorbție
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbția nu poate fi negativă")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funcție pentru a calcula volumul probei
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Masa probei trebuie să fie pozitivă")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Concentrația de proteină calculată trebuie să fie pozitivă")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Exemplu de utilizare
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Pentru absorbția %.2f și masa dorită de proteină %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Concentrația de proteină: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Volumul necesar al probei: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Eroare: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbția nu poate fi negativă");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Masa probei trebuie să fie pozitivă");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Concentrația de proteină calculată trebuie să fie pozitivă");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Exemplu de utilizare
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Pentru absorbția ${absorbance} și masa dorită de proteină ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Concentrația de proteină: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Volumul necesar al probei: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Eroare: ${error.message}`);
37}
38Relația dintre absorbție și concentrația de proteină este de obicei liniară într-un anumit interval. Mai jos este o vizualizare a unei curbe standard BCA:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Diferitele metode de cuantificare a proteinelor au diverse avantaje și limitări. Iată cum se compară testul BCA cu alte metode comune:
| Metodă | Interval de Sensibilitate | Avantaje | Limitări | Cel Mai Bun Pentru |
|---|---|---|---|---|
| Test BCA | 5-2000 μg/mL | • Compatibil cu detergenții • Variabilitate mai mică între proteine • Stabilitate în dezvoltarea culorii | • Interferat de agenți reducători • Afectat de unele agenți chelatori | • Cuantificarea generală a proteinelor • Probe care conțin detergenți |
| Test Bradford | 1-1500 μg/mL | • Rapid (2-5 min) • Puține substanțe interferente | • Variabilitate mare între proteine • Incompatibil cu detergenții | • Măsurători rapide • Probe fără detergenți |
| Metoda Lowry | 1-1500 μg/mL | • Bine stabilită • Bună sensibilitate | • Multe substanțe interferente • Pași multipli | • Consistență istorică • Probe pure de proteină |
| Absorbție UV (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Non-distructiv • Foarte rapid • Fără reactivi necesari | • Afectat de acizi nucleici • Necesită probe pure | • Soluții pure de proteină • Verificări rapide în timpul purificării |
| Fluorometric | 0.1-500 μg/mL | • Sensibilitate maximă • Interval dinamic larg | • Reagenți costisitori • Necesită fluorometru | • Probe foarte diluate • Volum de probă limitat |
Testul BCA (acid bicinchoninic) este utilizat în principal pentru cuantificarea concentrației totale de proteină într-o probă. Este utilizat pe scară largă în biochimie, biologie celulară și biologie moleculară pentru aplicații precum blotting-ul western, teste enzimatice, imunoprecipitare și purificarea proteinelor.
Testul BCA este în general precis în intervalul de 5-10% atunci când este efectuat corect. Acuratețea sa depinde de mai mulți factori, inclusiv calitatea curbei standard, absența substanțelor interferente și dacă compoziția proteinelor necunoscute este similară cu proteina standard utilizată.
Mai multe substanțe pot interfera cu rezultatele testului BCA, inclusiv:
Principalele diferențe sunt:
Dacă calculatorul dumneavoastră arată un volum foarte mare, de obicei indică o concentrație scăzută a proteinelor în proba dumneavoastră. Acest lucru ar putea fi din cauza:
Considerați concentrarea probei dumneavoastră sau ajustați designul experimental pentru a acomoda concentrația mai mică de proteină.
Acest calculator este conceput special pentru rezultatele testului BCA. Deși principiul de bază (convertirea concentrației în volum) se aplică și altor metode, relația dintre absorbție și concentrația de proteină variază între diferite teste. Pentru alte metode, cum ar fi Bradford sau Lowry, ar trebui să utilizați parametrii diferiți ai curbei standard.
Pentru citirile de absorbție în afara intervalului liniar (de obicei >2.0):
Albumina din ser bovin (BSA) este standardul cel mai frecvent utilizat pentru testele BCA deoarece este:
Cu toate acestea, dacă probele dumneavoastră conțin o proteină predominantă care diferă semnificativ de BSA, luați în considerare utilizarea acelei proteine ca standard pentru rezultate mai precise.
Culoarea violet dezvoltată în reacția BCA este stabilă timp de câteva ore la temperatura camerei și poate fi măsurată oricând în această perioadă. Cu toate acestea, pentru cele mai bune rezultate, este recomandat să măsurați toate standardele și probele aproximativ în același timp după dezvoltarea culorii.
Deși este tehnic posibil să reutilizați o curbă standard, nu este recomandat pentru cuantificare precisă. Variațiile în reactivi, condițiile de incubație și calibrarea instrumentului pot afecta relația dintre absorbție și concentrația de proteină. Pentru rezultate fiabile, generați o curbă standard proaspătă de fiecare dată când efectuați testul.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instrucțiuni. Disponibil la: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Acum că înțelegeți principiile din spatele cuantificării proteinelor BCA și calculului volumului de probă, încercați calculatorul nostru pentru a simplifica fluxul de lucru din laborator. Introduceți pur și simplu citirile de absorbție și masa dorită a probei pentru a obține calcule instantanee și precise ale volumului probei.
Indiferent dacă pregătiți probe pentru blotting-ul western, teste enzimatice sau orice alt experiment bazat pe proteine, calculatorul nostru va ajuta să asigurați rezultate consistente și fiabile. Economisiți timp, reduceți erorile și îmbunătățiți reproducibilitatea experimentelor dumneavoastră cu Calculatorul de Volum de Proba pe Baza de Absorbție BCA.
Descoperiți mai multe instrumente care ar putea fi utile pentru fluxul dvs. de lucru