qPCR калкулатор ефикасности: Алат за анализу стандардне криве

Калкулатор ефикасности qPCR-а

Калкулатор ефикасности qPCR-а процењује колико добро реакција квантитативне PCR (qPCR) копира циљну секвенцу ДНК током сваког циклуса амплификације. Он користи Ct вредности (број циклуса при којем флуоресцентни сигнал прелази задати праг) из серије разблажења да би израчунао ефикасност, нагиб, одсечак и R².

Шта је ефикасност qPCR-а?

Квантитативна PCR прати флуоресценцију док реакција копира циљну секвенцу ДНК, циклус по циклус. Ефикасност амплификације описује за колико се количина циљне ДНК повећава у сваком циклусу. При ефикасности од 100%, количина циљне ДНК се удвостручује у сваком циклусу.

Стварне реакције ретко достижу тачно 100%. Већина лабораторија сматра ефикасност између 90% и 110% прихватљивом за поуздану квантификацију. Вредност испод 90% или изнад 110% указује на проблем, као што су лош дизајн прајмера, инхибитори PCR-а пренети екстракцијом узорка или грешке при пипетирању у серији разблажења.

Ефикасност је најважнија при поређењу експресије гена између узорака. Уобичајена метода ΔΔCt за израчунавање промене експресије претпоставља да се свака реакција одвија при ефикасности од 100%. Када се измерена ефикасност разликује од 100%, или када циљни и референтни ген имају различите ефикасности, резултати промене експресије могу бити нетачни.

Формула ефикасности qPCR-а

Ефикасност се израчунава из нагиба стандардне криве, праве добијене наношењем Ct вредности у односу на логаритам количине почетне ДНК у серији разблажења по основи 10 (log10).

E = 10^(-1/nagib) - 1

E је ефикасност, изражена као децимални број (помножите је са 100 за проценат). Нагиб је нагиб праве стандардне криве. Негативан је зато што Ct расте како количина почетне ДНК опада.

Нагиб од -3,32 одговара ефикасности од 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

То следи зато што би разблажење од 10 пута требало да помери Ct за око 3,32 циклуса ако реакција удвостручује количину ДНК у сваком циклусу, пошто је log2(10) приближно 3,32.

У пракси се нагиб између -3,1 и -3,6 сматра прихватљивим. Тај опсег одговара ефикасности од приближно 90% до 110%. Нагиб ближи -3,1 даје већу израчунату ефикасност, а нагиб ближи -3,6 мању.

Како израчунати ефикасност qPCR-а: метода стандардне криве

1. Припремите серију разблажења. Почните од најконцентрованијег узорка и разблажујте га фиксним фактором, најчешће 10 пута, за сваки наредни узорак. Извршите qPCR на сваком разблажењу и забележите његову Ct вредност.
2. Претворите свако разблажење у вредност log10. Ако се први, најконцентрованији узорак означи као позиција 0, узорак под бројем i има log10(релативне количине) једнак -i × log10(фактора разблажења).
3. За свако разблажење нанесите Ct (на вертикалну осу) у односу на вредност log10 (на хоризонталну осу) и извршите линеарну регресију.
4. Очитајте нагиб, одсечак и R² регресионе праве.
5. Уврстите нагиб у E = 10^(-1/нагиб) - 1 да бисте добили ефикасност.

Критеријуми квалитета стандардне криве

• R² од најмање 0,98. Ово мери колико се тачке добро уклапају у праву. Нижа вредност често указује на грешке при пипетирању или неуједначену амплификацију.
• Нагиб између -3,1 и -3,6. Тај опсег одговара ефикасности од 90–110%.
• Најмање три тачке разблажења. Пет или шест тачака дају поузданију праву и олакшавају уочавање издвојене вредности.
• Најконцентрованији узорак треба да да Ct око 15-20. Најразблаженији узорак треба да остане испод Ct 35, јер се вредности изнад тога приближавају граници детекције.

Решени пример

Серија разблажења од пет тачака, са разблажењем од 10 пута, даје следеће Ct вредности, од најконцентрованијег до најразблаженијег узорка: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Вредности log10(релативне количине) су 0, -1, -2, -3, -4, пошто сваки корак разблажења додаје -log10(10), односно -1. Ct расте за 3,5 циклуса при сваком кораку, па тачке леже на правој, а линеарна регресија даје:

• Нагиб: -3,5
• Одсечак: 15,0
• R²: 1,0

Ефикасност: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, односно око 93%.

Ефикасност од 93% са R² = 1,0 испуњава стандардне критеријуме квалитета и погодна је за квантификацију експресије гена.

Пример кода

Ова функција у Јаваскрипту прати исти поступак као калкулатор. Индекс сваке Ct вредности се негира пре израчунавања логаритма, јер први, најконцентрованији узорак има највећу релативну количину, а сваки наредни узорак је разблаженији.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Зашто је ефикасност важна за експресију гена

Израчунавања промене експресије, укључујући методу ΔΔCt, претпостављају да свака реакција удвостручује количину циљне ДНК у сваком циклусу. Када циљни и референтни ген имају различите измерене ефикасности, једноставна формула ΔΔCt уноси грешку. Истраживачи често прелазе на израчунавање кориговано за ефикасност, као што је метода коју је описао Мајкл Пфафл у години 2001, када се ефикасности разликују за више од око пет процентних поена. Смернице MIQE, широко цитирани скуп стандарда за извештавање о qPCR-у објављен 2009, препоручују да студије уз резултате квантификације наведу израчунату ефикасност, нагиб и R².

Најчешће постављана питања

Који проценат ефикасности qPCR-а се сматра добрим?

Вредност између 90% и 110% се обично прихвата, а добро оптимизовани тестови постижу око 95–105%. Нагиб од -3,32 одговара тачној ефикасности од 100%.

Зашто је ефикасност мог qPCR-а изнад 110%?

Уобичајени узроци обухватају грешке при пипетирању у серији разблажења, димере прајмера, инхибиторе који неједнако утичу на концентроване и разблажене узорке или флуоресцентни праг постављен изван експоненцијалне фазе амплификације. Крива топљења са више од једног врха може указивати на димере прајмера.

Зашто је ефикасност мог qPCR-а испод 90%?

Могући узроци обухватају лош дизајн прајмера, инхибиторе PCR-а пренете екстракцијом узорка или неоптималну температуру хибридизације. Провера специфичности прајмера и извођење температурног градијента могу помоћи у проналажењу узрока.

Шта значи ниска вредност R²?

R² мери колико се Ct вредности добро уклапају у праву у односу на логаритам количине. Вредност испод 0,98 указује на неуједначено пипетирање, инхибирани узорак или тачку разблажења близу границе детекције.

Колико је тачака разблажења потребно за стандардну криву?

Најмање три, што је минимум потребан за линеарну регресију. Пет или шест тачака дају поузданији нагиб и олакшавају уочавање издвојених вредности.

Може ли се ефикасност мењати између експеримената?

Да. Нова серија реагенса, нова серија прајмера, друга врста узорка или други qPCR инструмент могу променити ефикасност. Многе лабораторије поново проверавају ефикасност сваких неколико месеци или при свакој новој серији реагенса.

Литература

1. Бастин С. А., Бенеш В., Гарсон Ј. А. и др. Смернице MIQE: минималне информације за објављивање експеримената квантитативне PCR у реалном времену. Клиничка хемија. 2009;55(4):611-622.
2. Пфафл М. В. Нови математички модел за релативну квантификацију RT-PCR-а у реалном времену. Истраживање нуклеинских киселина. 2001;29(9):e45.
3. Свец Д., Тихопад А., Новосадова В., Пфафл М. В., Кубиста М. Колико је добра процена ефикасности PCR-а: препоруке за прецизну и поуздану процену ефикасности qPCR-а. Биомолекуларна детекција и квантификација. 2015;3:9-16.