Калкулатор концентрације ДНК

Калкулатор концентрације ДНК претвара очитану апсорбанцу у UV области на 260 нанометара, названу A260, у концентрацију ДНК изражену у нанограмима по микролитру (ng/µL). Такође приказује укупну количину ДНК у узорку, у микрограмима (µg).

Шта је апсорбанца A260?

A260 је количина ултраљубичасте светлости коју раствор апсорбује на таласној дужини од 260 нанометара. ДНК најјаче апсорбује UV светлост у близини ове таласне дужине због својих нуклеотидних база. Спектрофотометар мери A260 након мерења слепе пробе, при чему се користи исти пуфер као за узорак, чиме се уклања апсорбанца позадине. Што је више ДНК у раствору, то је очитана вредност A260 већа.

Формула за концентрацију ДНК

Дволанчана ДНК апсорбује UV светлост сразмерно својој концентрацији, што је однос познат као Беров–Ламбертов закон. При стандардном оптичком путу дужине 1 центиметар, раствор са очитаном вредношћу A260 од 1,0 садржи приближно 50 ng/µL дволанчане ДНК. Овај број, фактор конверзије, претвара сваку вредност A260 у концентрацију:

Концентрација ДНК (ng/µL) = A260 × 50 × фактор разблажења

Фактор разблажења узима у обзир свако разблажење извршено пре мерења узорка. Узорак измерен без разблажења има фактор разблажења 1.

Како израчунати укупан принос ДНК

Када је концентрација позната, укупна маса ДНК у узорку може се израчунати на основу његове запремине:

Укупна ДНК (µg) = концентрација (ng/µL) × запремина (µL) ÷ 1000

Како израчунати концентрацију ДНК: корак по корак

Добро промешати узорак пре мерења. ДНК може да се залепи за зидове епрувете или да се неравномерно исталожи.
Разблажити узорак ако је веома концентрован, тако да очитана вредност A260 буде између 0,1 и 1,0. Очитавања спектрофотометра су најмање поуздана изван тог опсега.
Извршити мерење слепе пробе на спектрофотометру истим пуфером који је коришћен за разблажење, а затим измерити узорак на 260 nm.
Унети очитану вредност A260, запремину узорка и фактор разблажења у калкулатор да би се добили концентрација и укупан принос. Сва три поља морају бити попуњена, а запремина мора бити већа од нуле да би се приказао резултат.

Решени пример

Пример 1: неразблажени узорак

Очитана вредност A260 је 0,5, без разблажења (фактор разблажења 1), а запремина узорка је 100 µL.

Концентрација = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
Укупна ДНК = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Пример 2: разблажени узорак

У епрувети се налази 50 µL пречишћене ДНК. Мали део је разблажен 10 пута, а у разблаженом делу је очитана вредност A260 од 0,75. Фактор разблажења претвара ту вредност у концентрацију у оригиналној епрувети, а 50 µL је запремина унета за израчунавање укупног приноса.

Концентрација = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
Укупна ДНК = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Израчунавање фактора разблажења

Фактор разблажења = укупна запремина после разблажења ÷ запремина оригиналног узорка.

Додавањем 5 µL раствора ДНК у 45 µL пуфера добија се укупна запремина од 50 µL, па је фактор разблажења 50 ÷ 5 = 10. Узорак који није разблажен има фактор разблажења 1.

Уобичајени опсези концентрације ДНК

Концентрација зависи од врсте узорка и методе екстракције. Екстракти геномске ДНК обично имају концентрацију између приближно 10 и 100 ng/µL. Препарати плазмидне ДНК често дају веће концентрације, понекад од неколико стотина ng/µL. Резултат који је знатно изван очекиваног опсега за дату методу може указивати на проблем са екстракцијом или самим мерењем.

Ограничења мерења UV апсорбанце

Мерење A260 је брзо, али није најосетљивија ни најспецифичнија метода за ДНК. Протеини, РНК и неке компоненте пуфера такође апсорбују светлост у близини 260 nm и могу повећати очитану вредност. Научници често проверавају однос A260/A280 заједно са концентрацијом како би открили контаминацију протеинима; однос близу 1,8 обично указује на чист узорак ДНК. Методе засноване на флуоресцентним бојама, као што су Qubit тестови, везују се само за дволанчану ДНК и дају тачније очитавање код разблажених или нечистих узорака, али захтевају додатне реагенсе и флуорометар.

Најчешће постављана питања

Како се концентрација ДНК израчунава из вредности A260?

Помножити очитану вредност A260 са 50, стандардним фактором конверзије за дволанчану ДНК, а затим резултат помножити фактором разблажења. Ако узорак није разблажен, користити фактор разблажења 1.

Који је добар однос A260/A280?

Однос близу 1,8 обично указује на чист узорак ДНК. Мањи однос указује на контаминацију протеинима. Однос већи од 2,0 може указивати на контаминацију РНК.

Да ли се овај калкулатор може користити за РНК?

Не директно, јер се за РНК користи фактор конверзије од 40 ng/µL уместо 50. За процену концентрације РНК, помножити резултат калкулатора са 0,8 (40 ÷ 50) или директно користити A260 × 40 × фактор разблажења.

Зашто би очитавање A260 требало да буде између 0,1 и 1,0?

Апсорбанца остаје приближно сразмерна концентрацији, како је описано Беровим–Ламбертовим законом, углавном унутар овог опсега. Изван њега очитавања постају мање поуздана, па узорак који је превише концентрован или превише разблажен треба поново разблажити или концентровати пре мерења.

Која је разлика између концентрације и чистоће?

Концентрација мери количину присутне ДНК, у ng/µL. Чистоћа мери колико је узорак чист, углавном на основу односа апсорбанци, као што је A260/A280. Узорак може имати високу концентрацију, а ипак бити нечист, или ниску концентрацију и бити веома чист.

Како претворити ng/µL у µg/mL?

Те две јединице су бројчано једнаке. 1 ng/µL једнако је 1 µg/mL, јер се и јединица масе и јединица запремине скалирају фактором 1000.

Литература

Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. издање). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.

Калкулатор концентрације ДНК | A260 до ng/μL конвертор