Izračunajte koncentraciju DNK na osnovu očitavanja apsorbancije (A260) sa podesivim faktorima razređenja. Osnovni alat za laboratorije molekularne biologije i genetska istraživanja.
Koncentracija DNK se izračunava pomoću sledeće formule:
Kalkulator koncentracije DNK je neophodan online alat koji pomaže molekularnim biologima, genetičarima i laboratorijskim tehničarima da precizno odrede koncentraciju DNK na osnovu spektrofotometrijskih očitavanja. Ovaj besplatni kalkulator koristi standardnu A260 metodu za konverziju UV apsorbancije u tačne vrednosti koncentracije DNK u ng/μL.
Merenje koncentracije DNK je osnovna procedura u laboratorijama molekularne biologije, koja služi kao kritična kontrola kvaliteta pre PCR-a, sekvenciranja, kloniranja i drugih molekularnih tehnika. Naš kalkulator eliminiše ručne proračune i smanjuje greške prilikom određivanja i koncentracije i ukupnih količina DNK u vašim uzorcima.
Računanje koncentracije DNK se oslanja na Beer-Lambertov zakon, koji kaže da je apsorbancija rastvora direktno proporcionalna koncentraciji apsorbujućih vrsta u rastvoru i dužini svetlosnog puta kroz rastvor. Za dvostruku DNK, apsorbancija od 1.0 na 260nm (A260) u cuveti sa dužinom puta od 1cm odgovara koncentraciji od približno 50 ng/μL.
Koncentracija DNK se računa pomoću sledeće formule:
Gde:
Ukupna količina DNK u uzorku se može izračunati kao:
Apsorbancija na 260nm (A260):
Faktor konverzije (50):
Faktor razblaženja:
Zapremina:
Pratite ovaj jednostavan proces da izračunate koncentraciju DNK iz vaših A260 očitavanja:
Merenje koncentracije DNK je neophodno za brojne primene u molekularnoj biologiji i istraživanju:
Pre ligacije DNK fragmenata u vektore, poznavanje tačne koncentracije omogućava istraživačima da izračunaju optimalan odnos umetanja i vektora, maksimizirajući efikasnost transformacije. Na primer, molarni odnos 3:1 umetanja i vektora često daje najbolje rezultate, što zahteva precizna merenja koncentracije oba komponenta.
PCR reakcije obično zahtevaju 1-10 ng DNK uzorka za optimalnu amplifikaciju. Premalo DNK može dovesti do neuspeha amplifikacije, dok previše može inhibirati reakciju. Za kvantitativni PCR (qPCR), još preciznije kvantifikovanje DNK je neophodno za osiguranje tačnih standardnih krivulja i pouzdane kvantifikacije.
Protokoli pripreme NGS biblioteka precizno određuju tačne količine DNK ulaza, često u rasponu od 1-500 ng u zavisnosti od platforme i primene. Tačno merenje koncentracije je ključno za uspešnu pripremu biblioteka i uravnoteženo predstavljanje uzoraka u multiplex sekvenciranju.
Kada se DNK unosi u eukariotske ćelije, optimalna količina DNK varira u zavisnosti od tipa ćelije i metode transfekcije. Obično se koristi 0.5-5 μg plazmidne DNK po bunaru u formatu 6-bunarske ploče, što zahteva precizno merenje koncentracije za standardizaciju eksperimenata.
U forenzičkim aplikacijama, DNK uzorci su često ograničeni i dragoceni. Tačna kvantifikacija omogućava forenzičarima da odrede da li je prisutna dovoljna DNK za profilisanje i da standardizuju količinu DNK koja se koristi u narednim analizama.
Restrikcioni enzimi imaju specifične jedinice aktivnosti definisane po μg DNK. Poznavanje tačne koncentracije DNK omogućava pravilne odnose enzima i DNK, osiguravajući potpunu digestiju bez "star" aktivnosti (nespecifičnog sečenja).
Iako je UV spektrofotometrija najčešća metoda za kvantifikaciju DNK, postoje i nekoliko alternativa:
Fluorometrijske metode:
Agarozna gel elektroforeza:
Real-time PCR:
Digital PCR:
Sposobnost tačnog merenja koncentracije DNK značajno se razvijala zajedno sa napretkom u molekularnoj biologiji:
Nakon otkrića strukture DNK od strane Votsona i Krika 1953. godine, naučnici su počeli da razvijaju metode za izolaciju i kvantifikaciju DNK. Rane pristupe su se oslanjale na kolorimetrijske testove kao što je reakcija diphenylamine, koja je proizvodila plavu boju kada je reagovala sa deoksiriboza šećerima u DNK. Ove metode su bile relativno neosetljive i podložne smetnjama.
Primena UV spektrofotometrije za kvantifikaciju nukleinskih kiselina postala je široko rasprostranjena 1970-ih. Naučnici su otkrili da DNK apsorbuje UV svetlost sa maksimumom na 260nm, i da je odnos između apsorbancije i koncentracije linearan unutar određenog opsega. Faktor konverzije od 50 ng/μL za dvostruku DNK na A260 = 1.0 uspostavljen je tokom ovog perioda.
Razvoj fluorescentnih boja specifičnih za DNK u 1980-ima i 1990-ima revolucionisao je kvantifikaciju DNK, posebno za razređene uzorke. Hoechst boje i kasnije PicoGreen omogućile su mnogo osetljivije detekcije nego što je to bilo moguće sa spektrofotometrijom. Ove metode su postale posebno važne sa pojavom PCR-a, koji često zahteva preciznu kvantifikaciju sitnih količina DNK.
Uvođenje spektrofotometara za mikrovolumene poput NanoDrop-a u ranim 2000-im transformisalo je rutinsku kvantifikaciju DNK zahtevajući samo 0.5-2 μL uzorka. Ova tehnologija je eliminisala potrebu za razblaženjima i cuvetama, čineći proces bržim i praktičnijim.
Danas, napredne tehnike poput digitalnog PCR-a i sekvenciranja nove generacije pomerile su granice kvantifikacije DNK još dalje, omogućavajući apsolutnu kvantifikaciju specifičnih sekvenci i detekciju pojedinačnih molekula. Međutim, osnovni spektrofotometrijski princip uspostavljen pre decenijama ostaje osnova rutinskog merenja koncentracije DNK u laboratorijama širom sveta.
Hajde da prođemo kroz neke praktične primere proračuna koncentracije DNK:
Istraživač je pročistio plazmid i dobio sledeća merenja:
Proračun:
Nakon ekstrakcije genomske DNK iz krvi:
Proračun:
Protokol za sekvenciranje zahteva tačno 500 ng DNK:
Potrebna zapremina = 500 ÷ 125 = 4 μL DNK rastvora
Evo primera kako izračunati koncentraciju DNK u različitim programskim jezicima:
1' Excel formula za koncentraciju DNK
2=A260*50*FaktorRazblaženja
3
4' Excel formula za ukupnu količinu DNK u μg
5=(A260*50*FaktorRazblaženja*Zapremina)/1000
6
7' Primer u ćeliji sa A260=0.5, FaktorRazblaženja=2, Zapremina=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Rezultat: 5 μg
101def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2 """
3 Izračunajte koncentraciju DNK u ng/μL
4
5 Parametri:
6 absorbance (float): Očitavanje apsorbancije na 260nm
7 dilution_factor (float): Faktor razblaženja uzorka
8
9 Vraća:
10 float: Koncentracija DNK u ng/μL
11 """
12 return absorbance * 50 * dilution_factor
13
14def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
15 """
16 Izračunajte ukupnu količinu DNK u μg
17
18 Parametri:
19 concentration (float): Koncentracija DNK u ng/μL
20 volume_ul (float): Zapremina DNK rastvora u μL
21
22 Vraća:
23 float: Ukupna količina DNK u μg
24 """
25 return (concentration * volume_ul) / 1000
26
27# Primer korišćenja
28absorbance = 0.8
29dilution_factor = 5
30volume = 75
31
32concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
33total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
34
35print(f"Koncentracija DNK: {concentration:.2f} ng/μL")
36print(f"Ukupna DNK: {total_dna:.2f} μg")
37function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) { // Vraća koncentraciju DNK u ng/μL return absorbance * 50 * dilutionFactor; }
Otkrijte više alata koji mogu biti korisni za vaš radni proces