ДНК Лигациони Калкулатор - Израчунавање Односа Инсерта и Вектора за Молекуларно Клонирање

Увод

Постизање правилног моларног односа у лигацији ДНК може бити пресудно за успешно клонирање. Ако сте икада провели дане решавајући проблеме са лигационом реакцијом, тек да бисте схватили да однос инсерта и вектора није био одговарајући, знате колико су ови прорачуни критични.

Овај Калкулатор за лигацију ДНК одређује оптималне количине вектора и инсерта ДНК потребне за експерименте молекуларног клонирања. Основно начело је једноставно: постизање исправног моларног односа између плазмидног вектора и ДНК инсерта. Оно што је мање очигледно јесте да једнаке масе не значе и једнак број молекула - инсерт од 1 kb знатно је лакши од вектора од 5 kb, тако да треба прилагодити количине на основу величине фрагмента.

Оно што углавном даје поуздане резултате јесте: моларни однос инсерта и вектора од 3:1 до 5:1 за већину стандардних клонирајућих примена. Међутим, лигације тупих крајева често имају користи од виших односа, док велики инсерти (>10 kb) могу захтевати ниже односе. Ово нису произвољни бројеви - они одражавају деценије емпиријске оптимизације молекуларних биолога широм света, документовани у изворима попут приручника за молекуларно клонирање Cold Spring Harbor-а и протокола New England Biolabs-а.

Без обзира да ли градите експресионе векторе, стварате генске библиотеке или решавате проблеме са тврдоглавим субклонирањем, тачни прорачуни штеде и време и скупе реагенсе. Уобичајена грешка је заборављање да се узму у обзир варијације концентрације ДНК након gel пречишћавања - ваше мерење на nanodrop-у је важније него што мислите.

ДНК лигација - формула и калкулација

Калкулација иза ДНК лигације је једноставнија него што се на први поглед чини. У суштини, решавате проблем молекуларне биологије: како добити прави број молекула инсерта у односу на молекуле вектора када су различитих величина?

Формула узима у обзир величине фрагмената и концентрације да би се постигао циљани моларни однос. Разумевање ове калкулације помаже вам да откријете узрок проблема - ако ваша лигација не функционише, можете брзо проверити да ли су количине ДНК проблем.

Калкулација количине инсерта

Потребна количина ДНК инсерта (у нанограмима) се израчунава следећом формулом:

$\text{ng инсерта} = \text{ng вектора} \times \frac{\text{kb величина инсерта}}{\text{kb величина вектора}} \times \text{моларни однос}$

Где:

• ng вектора = количина ДНК вектора коришћена у реакцији (уобичајено 50-100 ng)
• kb величина инсерта = дужина ДНК инсерта у килобазама (kb)
• kb величина вектора = дужина ДНК вектора у килобазама (kb)
• моларни однос = жељени однос молекула инсерта према молекулима вектора (уобичајено 3:1 до 5:1)

Калкулације запремина

Након одређивања потребне количине ДНК инсерта, израчунавају се запремине потребне за реакцију:

$\text{Запремина вектора (μL)} = \frac{\text{ng вектора}}{\text{концентрација вектора (ng/μL)}}$

$\text{Запремина инсерта (μL)} = \frac{\text{ng инсерта}}{\text{концентрација инсерта (ng/μL)}}$

$\text{Запремина пуфера/воде (μL)} = \text{Укупна запремина реакције (μL)} - \text{Запремина вектора (μL)} - \text{Запремина инсерта (μL)}$

Пример калкулације: Клонирање гена од 1 kb у стандардни плазмид

Проћи ћемо кроз стваран сценариј - клонирање гена од 1 kb у типичан експресиони вектор:

Ваши ДНК узорци:

• Концентрација вектора: 50 ng/μL (скоро дигестован pET28a)
• Дужина вектора: 3000 bp (3 kb)
• Концентрација инсерта: 25 ng/μL (ваш PCR-амплификован ген, пречишћен гелом)
• Дужина инсерта: 1000 bp (1 kb)
• Циљани моларни однос: 3:1 (инсерт:вектор)
• Укупна запремина реакције: 20 μL
• Количина вектора: 50 ng (стандардна почетна количина)

Корак 1: Израчунавање потребне количине инсерта $\text{ng инсерта} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Приметите да је инсерт једна трећина величине вектора, тако да нам треба мања маса да би се постигло више молекула.

Корак 2: Израчунавање потребних запремина $\text{Запремина вектора} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Запремина инсерта} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Запремина пуфера/воде} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Шта ово значи у пракси: Измешаћете 1 μL вектора, 2 μL инсерта, додаћете T4 ДНК лигазу (уобичајено 1 μL) и допунити до 20 μL лигационим пуфером. Ово обезбеђује три молекула инсерта на сваки молекул вектора - довољно да се реакција покрене без преоптерећења система.

Kako koristiti kalkulator za ligaciju DNK

Korišćenje ovog kalkulatora traje oko 30 sekundi nakon merenja koncentracije DNK. Evo radnog toka:

1. Unesite detalje vektora

• Koncentracija u ng/μL (proverite na Nanodrop ili Qubit merenju)
• Dužina u baznim parovima—proverite mapu plazmida ili podatke sekvenciranja
• Količina koju želite da koristite (50-100 ng odlično funkcioniše za većinu primena)

2. Dodajte informacije o insertu

• Koncentracija u ng/μL (izmereno nakon gel prečišćavanja za najbolju tačnost)
• Dužina fragmenta u baznim parovima

3. Postavite parametre reakcije

• Molski odnos: Počnite sa 3:1 za lepljive krajeve, 5:1 za tupe krajeve
• Ukupna zapremina: 10-20 μL je standardno (manje zapremine štede reagense, veće zapremine su lakše za precizno pipetiranje)

4. Pregledajte izračunate zapremine Kalkulator vam trenutno pokazuje:

• Tačne zapremine vektora i inserta za pipetiranje
• Koliko pufera za ligaciju ili vode treba dodati
• Ukupne količine DNK u vašoj reakciji

Ako kalkulator upozorava da zapremine ne odgovaraju, vaša DNK je ili previše razblažena ili je ukupna zapremina premala. Uobičajeno rešenje: koncentrujte DNK uzorke ili povećajte zapreminu reakcije.

Profesionalni savet: Kopirajte rezultate direktno u laboratorijski dnevnik. Budući vi će ceniti dokumentovane proračune kada budete rešavali probleme ili optimizovali protokol.

Примене у стварном свету и случајеви употребе

Стандардно молекуларно клонирање

Већина истраживача користи овај калкулатор за рутинске послове клонирања — убацивање гена у експресионе векторе, субклонирање између плазмида или конструисање извештајних анализа. Прорачуни временом постану други природ, али њихова провера спречава тренутке збуњености када лигација неочекивано затаји јер сте користили једнаке масе уместо једнаких мола.

Оптимизација експресије протеина

Када постављате системе експресије протеина, важно је да лигацију урадите исправно први пут. Високо-копијни вектори попут деривата pUC имају користи од нешто нижих односа инсерта (2:1 или 3:1) да би се избегло преоптерећење лигационе реакције. Овај калкулатор вам помаже да подесите те односе на основу величине вашег вектора.

Конструкција CRISPR вектора

Клонирање водећих РНК у CRISPR векторе представља јединствене изазове — често радите са веома малим инсертима (20-100 bp). Калкулатор обрађује ове сценарије где интуиција заказује. 60 bp gRNA инсерт у 9 kb вектору захтева пажљиве прорачуне односа, и управо овде прецизна математика спашава вас од неуспелих експеримената.

Синтетска биологија и вишефрагментна монтажа

Иако Gibson Assembly и Golden Gate клонирање имају другачије захтеве од традиционалне лигације, разумевање моларних односа остаје кључно. Овај калкулатор вам помаже да размислите о стехиометрији фрагмента, чак и ако користите алтернативне методе монтаже. Многи синтетски биолози га користе као полазну тачку пре прилагођавања за свој специфичан протокол.

Решавање проблема тешких лигација

Неке лигације су notorious тешке:

• Велики инсерти (>5 kb): Користите ниже односе (1:1 или 2:1) да избегнете стеричке проблеме
• Ситни фрагменти (<100 bp): Повећајте односе на 10:1 или више да компензујете неефикасности поправке крајева
• Лигације тупих крајева: Имају нижу ефикасност; почните са 5:1 односима и додајте PEG у реакцију
• AT-богате или GC-богате секвенце: Могу захтевати оптимизацију односа — калкулатор вам омогућава систематско експериментисање

Оно што се често превиди: после gel пречишћавања, концентрације ДНК могу бити значајно другачије од почетног материјала. Увек поново измерите пре израчунавања запремина лигације.

Када размислити о алтернативним методама клонирања

Традиционална лигација добро функционише за већину примена, али постоје и друге методе за специфичне сценарије:

Gibson Assembly постао је метод избора за монтажу више фрагмената у једној реакцији. И даље треба размишљати о односима фрагмената — генерално једнаки моларни износи функционишу, али математика је слична. Посебно корисно када градите сложене конструкте са 3+ фрагмента. Према оригиналном Gibson Assembly протоколу, одржавање приближно једнаких моларних количина свих фрагмента даје најбоље резултате.

Golden Gate Assembly сјајан је за понављајуће пројекте клонирања или при изградњи комбинаторних библиотека. Рестрикциони ензими типа IIS стварају директне, безбразне спојеве. Главна предност у односу на традиционалну лигацију је могућност монтаже више фрагмената у одређеном редоследу без остављања ožiljaka. Прорачуни су једноставнији — циљајте на једнаке моларне концентрације свих делова.

In-Fusion и слични китови за бешавно клонирање добро функционишу када желите да избегнете рестрикционе ензиме. Користе кратке (15 bp) регионе хомологије и власничке ензимске смеше. Ови комерцијални системи поједностављују прорачуне, али додају трошкове по реакцији — добро за мале пројекте, скупо за рутинске послове.

Gateway клонирање има смисла ако премештате gene између многих различитих вектора, посебно у високо-проточним поставкама. Почетна поставка захтева посебне векторе, али накнадни преноси су једноставни. Многе лабораторије користе ово за скрининг експресије кроз више система.

Емпиријска оптимизација и даље важи када радите са нарочито тврдоглавим конструктима. Поставите паралелне лигације са односима 1:1, 3:1, 5:1 и 10:1, а затим видите шта најбоље функционише. Овај систематски приступ често открива да ваша специфична комбинација вектора-инсерта има необичне преференце. Документујте оно што ради — ово знање уштеђује време на будућим сличним пројектима.

Кратка историја израчунавања ДНК лигације

Прича о израчунавањима лигације везана је за рођење саме технологије рекомбинантне ДНК. Када су Пол Берг, Херберт Бојер и Стенли Коен створили прве рекомбинантне ДНК молекуле почетком 1970-их, нико није израчунавао моларне односе - научници су користили методу покушаја и грешака да би открили шта функционише. Т4 ДНК лигаза из бактериофага зараженог E. coli постала је радна enzim, способна да спаја и тупе и лепљиве крајеве.

Током 1980-их и 1990-их, како је клонирање постало рутинско уместо revolucionarnog, појавили су се обрасци. Лабораторије су приметиле да вишак ДНК инсерта побољшава стопу успеха. Смерница моларног односа од 3:1 до 5:1 настала је из колективног искуства подељеног кроз протоколе, приручнике Cold Spring Harbor-а и безброј лабораторијских састанака. Математичка формула је сама по себи једноставна - само рачунање разлика у молекулској маси - али њена систематска примена дошла је постепено како су се најбоље праксе шириле кроз заједницу молекуларне биологије.

Прави заокрет догодио се 2000-их година са рачунарским алатима који су израчунавања учинили доступним изван менталне математике или истраживача са калкулаторима. Онлајн калкулатори демократизовали су прецизност, посебно корисни за компликоване сценарије попут клонирања великих инсерата или малих фрагмената где интуиција заказује. Занимљиво, чак и са новијим методама попут Гибсонове асемблаже, основни принцип контроле молекуларних односа остао је фундаментални - само га примењујемо другачије у зависности од укључене хемије.

Данашња израчунавања лигације почивају на истој основној математици развијеној пре деценија, refinisanoj милионима успешних (и неуспешних) експеримената клонирања широм истраживачких лабораторија широм света.

Примери кода

Овде су имплементације калкулатора за лигацију ДНК у различитим програмским језицима:

1' Excel VBA функција за калкулатор лигације ДНК
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Израчунавање потребне количине инсерта у ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Израчунавање запремине вектора у μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Израчунавање запремине инсерта у μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Израчунавање запремине пуфера/воде у μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Пример употребе у ћелији:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Израчунавање запремина за реакцију лигације ДНК.
5    
6    Параметри:
7    vector_concentration (float): Концентрација вектора ДНК у ng/μL
8    vector_length (float): Дужина вектора ДНК у базним паровима
9    insert_concentration (float): Концентрација инсерта ДНК у ng/μL
10    insert_length (float): Дужина инсерта ДНК у базним паровима
11    molar_ratio (float): Жељени молски однос инсерта:вектора
12    total_volume (float): Укупна запремина реакције у μL
13    vector_amount (float): Количина вектора ДНК за употребу у ng (подразумевано: 50)
14    
15    Враћа:
16    dict: Речник са израчунатим запреминама и количинама
17    """
18    # Израчунавање запремине вектора
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Израчунавање потребне количине инсерта
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Израчунавање запремине инсерта
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Израчунавање запремине пуфера/воде
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Пример употребе
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Вектор: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Инсерт: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Пуфер: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Укупно: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Конвертовање дужина у kb за израчунавање
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Израчунавање потребне количине инсерта
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Израчунавање запремина
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Пример употребе
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Вектор: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Инсерт: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Пуфер: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Укупно: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Конвертовање дужина у kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Израчунавање потребне количине инсерта
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Израчунавање запремина
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Заокруживање на 2 децимале
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Вектор: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Инсерт: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Пуфер: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Укупно: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Конвертовање дужина у kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Израчунавање потребне количине инсерта
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Израчунавање запремина
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Заокруживање на 2 децимале
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Вектор: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Инсерт: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Пуфер: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Укупно: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Често постављана питања

Који је оптимални моларни однос за ДНК лигацију?

Почните са 3:1 (инсерт:вектор) за лигације са лепљивим крајевима — овај однос поуздано функционише за већину стандардних клонирања. Лигације са тупим крајевима имају нижу ефикасност, па их гурните до 5:1 или чак и више.

Ево шта функционише у пракси:

• Лигације са лепљивим крајевима: 1:1 до 3:1 (почните са 3:1)
• Лигације са тупим крајевима: 5:1 до 10:1
• Велики инсерти (>10 kb): 1:1 до 2:1 (стерична сметња постаје фактор)
• Мали инсерти (<500 bp): 5:1 до 10:1 (надокнађује потенцијално оштећење крајева)
• Вишеструки фрагментни склоп: 3:1 за сваки инсерт у односу на вектор

Када сте у недоумици, водите паралелне реакције са различитим односима. Одузима додатни сат припреме, али штеди дане troubleshootinga.

[Превод се наставља...]

Референце

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Молекуларно клонирање: Лабораторијски приручник (3. издање). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Молекуларно клонирање: Лабораторијски приручник (4. издање). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). Метод прецизног клонирања у једном кораку са високим капацитетом протока. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Ензиматска изградња ДНК молекула до неколико стотина килобаза. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Клонирање PCR производа независно од лигације (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Макромолекуларно гужвање омогућава лигацију тупих крајева помоћу ДНК лигаза из јетре пацова или Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Молекуларно-биолошка референца. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - Протокол за ДНК лигацију. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Техничка референца за молекуларно клонирање. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Технички приручник за клонирање. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/