Proteinlöslighetsberäknare - Gratis pH & Temperaturverktyg

En beräknare för proteinlöslighet uppskattar den högsta koncentration av ett protein som förblir löst i ett lösningsmedel vid ett givet pH-värde, en given temperatur och jonstyrka. Den omvandlar grundläggande kemi till ett enda tal, i milligram protein per milliliter lösningsmedel.

Proteinlöslighet är viktig inom biokemi, läkemedelsformulering och livsmedelsvetenskap. Ett protein som inte förblir löst bildar aggregat eller fällningar, vilket kan förstöra ett experiment eller göra ett läkemedel omöjligt att injicera.

Så beräknas proteinlöslighet

Lösligheten beror på fem saker: proteinets isoelektriska punkt (det pH-värde vid vilket dess nettoladdning är noll), dess smältpunkt (den temperatur vid vilken det börjar vecklas ut), lösningsmedlets dielektricitetskonstant (ett mått på hur väl det separerar laddade partiklar), lösningens pH-värde och jonstyrkan (ett mått på hur mycket löst salt som finns).

Beräknaren utgår från varje proteins kända löslighet i vatten under en uppsättning referensförhållanden: 25 °C, pH 7,0 och en jonstyrka på 0,15 M (ungefär samma saltnivå som i blod). Därefter multipliceras referensvärdet med fyra kvoter, en för varje förhållande som har ändrats.

Formel för proteinlöslighet

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ är proteinets kända löslighet i vatten under referensförhållandena, i mg/ml.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, där $pI$ är proteinets isoelektriska punkt. Lösligheten är lägst vid den isoelektriska punkten och ökar när pH-värdet avviker från den, för att sedan plana ut inom ett par pH-enheter.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, där $I$ är jonstyrkan i mol per liter. Vid låga saltnivåer ökar denna term lösligheten något (”insaltning”). Vid höga saltnivåer minskar den lösligheten (”utsaltning”).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, där $T_m$ är proteinets smältpunkt i °C. Lösligheten ökar långsamt med temperaturen och minskar sedan kraftigt när temperaturen närmar sig $T_m$ och proteinet börjar vecklas ut.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, där $\varepsilon$ är lösningsmedlets dielektricitetskonstant. Vatten har dielektricitetskonstanten 78,4, så denna term är lika med 1 i vatten. Lösningsmedel som separerar laddningar mindre effektivt än vatten, till exempel etanol, minskar lösligheten.

Referensvärden som används av beräknaren

Löslighetskategorier

Exempel: albumin i fosfatbuffert

Bestäm lösligheten för albumin i fosfatbuffert vid 25 °C, pH 7,4 och en jonstyrka på 0,15 M.

Albuminets referensvärden är $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/ml och $T_m = 63°C$. Fosfatbuffert har dielektricitetskonstanten 76,0.

1. pH-term: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Kvot: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Jonterm: jonstyrkan (0,15 M) är lika med referensvärdet, så kvoten är 1.
3. Temperaturterm: temperaturen (25 °C) är lika med referensvärdet, så kvoten är 1.
4. Lösningsmedelsterm: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/ml}$

Beräknaren anger 492,12 mg/ml, vilket tillhör kategorin ”mycket lösligt”.

Exempel: lysozym i glycerol vid låg temperatur

Bestäm lösligheten för lysozym i en glycerollösning vid 4 °C, pH 5,0 och en jonstyrka på 0,1 M. Detta liknar förhållandena vid kall förvaring av ett enzym.

Lysozymets referensvärden är $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/ml och $T_m = 72°C$. Glycerol har dielektricitetskonstanten 42,5.

1. pH-term: en förändring från pH 7,0 till pH 5,0 (båda långt under lysozymets pI på 11,35) ändrar pH-termen endast något. Kvot: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Jonterm: när jonstyrkan minskar från 0,15 M till 0,1 M ökar lösligheten något genom salting-in-effekten. Kvot: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Temperaturterm: nedkylning från 25 °C till 4 °C, långt under smältpunkten, sänker termen. Kvot: 0,8106.
4. Lösningsmedelsterm: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/ml}$

Beräknaren anger 35,88 mg/ml, vilket tillhör kategorin ”lösligt”. Det är glycerolens låga dielektricitetskonstant, inte den kalla temperaturen, som sänker resultatet från referensvärdet.

Så använder du beräknaren för proteinlöslighet

1. Välj ett protein i listan: albumin, insulin, lysozym, hemoglobin, myoglobin, kollagen, kasein eller fibrinogen.
2. Välj ett lösningsmedel: vatten, fosfatbuffert, Trisbuffert, glycerol, DMSO, metanol, etanol eller aceton.
3. Ange temperaturen i °C (0 till 100), pH-värdet (0 till 14) och jonstyrkan i molaritet (0 till 2).
4. Läs av den beräknade lösligheten i mg/ml och dess kategori. En stapel under resultatet visar värdet på en skala från 0 till 100 mg/ml och fylls helt vid 100 mg/ml eller mer.

Vad påverkar proteinlöslighet

pH och den isoelektriska punkten. Varje protein har en isoelektrisk punkt, det pH-värde vid vilket dess yta inte har någon nettoladdning. Vid detta pH-värde stöter proteinmolekylerna inte bort varandra, så de klumpar ihop sig och faller lättare ur lösningen. När pH-värdet flyttas bort från den isoelektriska punkten, i endera riktningen, får proteinet en nettoladdning. Laddade molekyler stöter bort varandra, vilket håller dem åtskilda och lösta.

Jonstyrka. Lösta saltjoner omger de laddade ytgrupperna på ett protein. Vid låga till måttliga koncentrationer skärmar dessa joner laddningar som annars skulle dra två proteinmolekyler mot varandra, vilket ökar lösligheten. Detta kallas salting in. Vid höga saltkoncentrationer konkurrerar jonerna med proteinet om vattenmolekyler och avlägsnar det vattenskikt som håller proteinet löst. Detta kallas salting out och ligger till grund för en vanlig reningsmetod där ammoniumsulfat används för att fälla ut proteiner ur en blandning.

Temperatur. Uppvärmning av en lösning ökar i allmänhet lösligheten, upp till en viss punkt. När temperaturen närmar sig proteinets smältpunkt börjar proteinet vecklas ut. Då exponeras hydrofoba (vattenavstötande) delar av proteinet som normalt är dolda inuti dess veckade struktur. Dessa exponerade delar fastnar i varandra och orsakar aggregering, så lösligheten minskar kraftigt nära och över smältpunkten.

Lösningsmedel. Ett lösningsmedels dielektricitetskonstant mäter hur effektivt det försvagar den elektriska attraktionen mellan laddade partiklar. Vatten har hög dielektricitetskonstant och separerar laddningar väl, vilket är anledningen till att de flesta proteiner löser sig bättre i vatten än i organiska lösningsmedel som etanol eller aceton. Lösningsmedel med låg dielektricitetskonstant gör att motsatta laddningar på olika proteinmolekyler attraherar varandra starkare, vilket främjar aggregering.

Begränsningar

Beräknaren använder en förenklad modell som bygger på ett litet urval referensproteiner och standardlösningsmedel. Den tar inte hänsyn till proteinets renhet, tillsatser som detergenter eller stabilisatorer eller ovanliga buffertkomponenter. Resultaten är uppskattningar för planering av experiment och ersätter inte direkt mätning av lösligheten i laboratoriet.

Vanliga frågor och svar

Vad är proteinlöslighet? Proteinlöslighet är den högsta koncentration av ett protein som förblir helt löst i ett lösningsmedel utan att bilda synliga aggregat eller fällning.

Varför är ett protein minst lösligt vid sin isoelektriska punkt? Vid den isoelektriska punkten har proteinet ingen nettoladdning, så proteinmolekylerna stöter inte längre bort varandra elektriskt. Utan denna repulsion fastnar de lättare i varandra och faller ur lösningen.

Vad är skillnaden mellan salting in och salting out? Salting in sker vid låga saltkoncentrationer, när lösta joner skärmar proteinets laddade grupper från varandra och ökar lösligheten. Salting out sker vid höga saltkoncentrationer, när joner avlägsnar vatten från proteinets yta och minskar lösligheten.

Ökar högre temperatur alltid lösligheten? Nej. Lösligheten tenderar att öka med temperaturen endast upp till en viss punkt. När temperaturen närmar sig proteinets smältpunkt börjar proteinet vecklas ut, vilket vanligtvis orsakar aggregering och ett kraftigt fall i löslighet.

Varför löser sig proteiner sämre i etanol eller aceton än i vatten? Vatten har hög dielektricitetskonstant, vilket innebär att det mycket effektivt försvagar den elektriska attraktionen mellan laddade delar av proteinmolekyler. Etanol och aceton har lägre dielektricitetskonstanter, så laddade grupper på olika proteinmolekyler attraherar varandra starkare i dessa lösningsmedel, vilket gör aggregering mer sannolik.

Hur exakt är denna beräknare? Den ger en uppskattning baserad på en fysikalisk modell och ett litet urval referensproteiner och lösningsmedel. Den är användbar för att begränsa vilka förhållanden som bör testas, men experimentell mätning är fortfarande det enda sättet att bekräfta lösligheten för ett specifikt proteinprov.

Vidare läsning

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mekanismen bakom salting in och salting out av proteiner med tvåvärda katjonsalter. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Mätning och ökning av proteinlöslighet. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteiner, aminosyror och peptider som joner och dipolära joner. Reinhold Publishing.