Beräkna exakta provvolymer baserat på BCA-analysens absorbansavläsningar och önskad proteinmassa. Viktigt för konsekvent proteinladdning i western blots och andra laboratorieapplikationer.
Detta verktyg beräknar den nödvändiga provvolymen baserat på BCA-absorbansresultat och provets massa. Ange absorbansvärdet och provmassan för varje prov för att beräkna den motsvarande provvolymen.
Provvolymen beräknas med följande formel:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbans Volymberäknare för Prov är ett specialiserat verktyg som är utformat för att hjälpa forskare och laboratorietekniker att noggrant bestämma den lämpliga provvolymen för experiment baserat på BCA (bicinchoninsyra) assay-resultat. Denna kalkylator tar absorbansavläsningarna från din BCA-assay och din önskade provmassa för att beräkna den exakta volym som behövs för konsekvent proteinbelastning i tillämpningar som western blotting, enzymatiska tester och andra proteinanalysetekniker.
BCA-assayet är en av de mest använda metoderna för proteinkvantifiering i biokemi och molekylärbiologilaboratorier. Genom att mäta absorbansen av dina proteiner och jämföra dem med en standardkurva kan du bestämma proteinets koncentration med hög noggrannhet. Vår kalkylator strömlinjeformar denna process genom att automatiskt konvertera absorbansavläsningar till de exakta provvolymer som krävs för dina experiment.
Bicinchoninsyra (BCA) assay är en biokemisk assay för att bestämma den totala koncentrationen av protein i en lösning. Principen för denna assay bygger på bildandet av ett Cu²⁺-protein komplex under alkaliska förhållanden, följt av reduktion av Cu²⁺ till Cu¹⁺. Mängden reduktion är proportionell mot det närvarande proteinet. BCA bildar ett lila färgat komplex med Cu¹⁺ i alkaliska miljöer, vilket ger en grund för att övervaka reduktionen av koppar av proteiner.
Intensiteten av den lila färgen ökar proportionellt med proteinets koncentration, vilket kan mätas med en spektrofotometer vid cirka 562 nm. Absorbansavläsningarna jämförs sedan med en standardkurva för att bestämma proteinets koncentration i okända prover.
Den grundläggande formeln för att beräkna provvolym från BCA absorbansresultat är:
Där:
Protein koncentrationen beräknas från absorbansavläsningen med hjälp av en standardkurvans ekvation:
För en standard BCA-assay är den typiska koefficienten cirka 2.0, och interceptet ligger ofta nära noll, även om dessa värden kan variera beroende på dina specifika assayförhållanden och standardkurva.
Vår kalkylator förenklar processen att bestämma provvolymer från BCA-assayresultat. Följ dessa steg för att få noggranna beräkningar:
Ange Provinformation:
Välj Typ av Standardkurva:
Visa Resultat:
Kopiera eller Exportera Resultat:
Låt oss gå igenom ett praktiskt exempel:
Detta innebär att du bör lasta 13.33 μL av ditt prov för att få 20 μg protein.
Kalkylatorn ger flera viktiga bitar av information:
Protein koncentration: Detta beräknas från din absorbansavläsning med hjälp av den valda standardkurvan. Det representerar mängden protein per enhet volym i ditt prov (μg/μL).
Provvolym: Detta är volymen av ditt prov som innehåller din önskade mängd protein. Detta värde är vad du kommer att använda när du förbereder dina experiment.
Varningar och Rekommendationer: Kalkylatorn kan ge varningar för:
En av de vanligaste tillämpningarna för denna kalkylator är att förbereda prover för western blotting. Konsekvent proteinbelastning är avgörande för pålitliga western blot-resultat, och denna kalkylator säkerställer att du laddar samma mängd protein för varje prov, även när deras koncentrationer skiljer sig.
Exempel arbetsflöde:
För enzymatiska tester är det ofta nödvändigt att använda en specifik mängd protein för att standardisera reaktionsvillkoren över olika prover eller experiment.
Exempel arbetsflöde:
I immunprecipitationsexperiment är det viktigt att börja med en konsekvent mängd protein för att jämföra resultat över olika förhållanden.
Exempel arbetsflöde:
Under proteinrening är det ofta nödvändigt att spåra protein koncentration och beräkna utbyten vid olika steg.
Exempel arbetsflöde:
Även om kalkylatorn tillhandahåller standardparametrar för standard BCA-assayer kan du också ange anpassade värden om du har genererat din egen standardkurva. Detta är särskilt användbart när:
För att använda en anpassad standardkurva:
Kalkylatorn låter dig lägga till flera prover och beräkna deras volymer samtidigt. Detta är särskilt användbart när du förbereder prover för experiment som kräver konsekvent proteinbelastning över flera förhållanden.
Fördelar med batchbearbetning:
Om din absorbansavläsning är över 2.0 kan den vara utanför den linjära räckvidden för BCA-assayet. I sådana fall:
För absorbansavläsningar under 0.1 kan du vara nära detektionsgränsen för assayet, vilket kan påverka noggrannheten. Överväg:
Om kalkylatorn föreslår en volym som är för stor för din tillämpning:
Den exakta kvantifieringen av proteiner har varit ett grundläggande krav inom biokemi och molekylärbiologi sedan dessa områden uppstod. Tidiga metoder förlitade sig på bestämning av kväveinnehåll, vilket var tidskrävande och krävde specialiserad utrustning.
Kjeldahl Metod (1883): En av de tidigaste metoderna för protein kvantifiering, baserad på att mäta kväveinnehåll.
Biuret Test (Tidigt 1900-tal): Denna metod bygger på reaktionen mellan peptidbindningar och kopparjoner i en alkalisk lösning, vilket producerar en violett färg.
Lowry Assay (1951): Utvecklad av Oliver Lowry, denna metod kombinerade biuretreaktionen med Folin-Ciocalteu-reagenset, vilket ökade känsligheten.
Bradford Assay (1976): Marion Bradford utvecklade denna metod med Coomassie Brilliant Blue G-250-färg, som binder till proteiner och skiftar absorptionsmaximum.
BCA Assay (1985): Utvecklad av Paul Smith och kollegor vid Pierce Chemical Company, denna metod kombinerade biuretreaktionen med BCA-detektion, vilket erbjöd förbättrad känslighet och kompatibilitet med detergenter.
BCA-assayet beskrevs först i en artikel från 1985 av Smith et al. med titeln "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Det utvecklades för att ta itu med begränsningar hos befintliga metoder, särskilt störningar från olika kemikalier som vanligtvis används i proteinextraktion och rening.
Den nyckelinventionen var att använda bicinchoninsyra för att detektera Cu¹⁺-joner som produceras av proteinmedierad reduktion av Cu²⁺, vilket bildar ett lila färgat komplex som kunde mätas spektrofotometriskt. Detta gav flera fördelar:
Sedan sin introduktion har BCA-assayet blivit en av de mest använda metoderna för protein kvantifiering i biokemi och molekylärbiologilaboratorier världen över.
1=IF(B2<=0,"Fel: Ogiltig absorbans",IF(C2<=0,"Fel: Ogiltig provmassa",C2/(2*B2)))
2
3' Där:
4' B2 innehåller absorbansavläsningen
5' C2 innehåller den önskade provmassan i μg
6' Formeln returnerar den nödvändiga provvolymen i μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Beräkna protein koncentration från absorbans med hjälp av standardkurva."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbans kan inte vara negativ")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Beräkna nödvändig provvolym baserat på absorbans och önskad massa."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Provmassan måste vara positiv")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Beräknad protein koncentration måste vara positiv")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Exempelanvändning
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"För absorbans {absorbance} och önskad proteinmassa {sample_mass} μg:")
31 print(f"Protein koncentration: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Nödvändig provvolym: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Fel: {e}")
351# Funktion för att beräkna protein koncentration från absorbans
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbans kan inte vara negativ")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funktion för att beräkna provvolym
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Provmassan måste vara positiv")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Beräknad protein koncentration måste vara positiv")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Exempelanvändning
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("För absorbans %.2f och önskad proteinmassa %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Protein koncentration: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Nödvändig provvolym: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Fel: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbans kan inte vara negativ");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Provmassan måste vara positiv");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Beräknad protein koncentration måste vara positiv");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Exempelanvändning
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`För absorbans ${absorbance} och önskad proteinmassa ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Protein koncentration: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Nödvändig provvolym: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Fel: ${error.message}`);
37}
38Förhållandet mellan absorbans och protein koncentration är vanligtvis linjärt inom ett visst intervall. Nedan finns en visualisering av en standard BCA-kurva:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Olika protein kvantifieringsmetoder har olika fördelar och begränsningar. Här är hur BCA-assayet jämförs med andra vanliga metoder:
| Metod | Känslighetsområde | Fördelar | Begränsningar | Bäst För |
|---|---|---|---|---|
| BCA Assay | 5-2000 μg/mL | • Kompatibel med detergenter • Mindre protein-till-protein variation • Stabil färgutveckling | • Störs av reduktionsmedel • Påverkas av vissa chelaterande ämnen | • Allmän protein kvantifiering • Prover som innehåller detergenter |
| Bradford Assay | 1-1500 μg/mL | • Snabb (2-5 min) • Få störande ämnen | • Hög protein-till-protein variation • Inkompatibel med detergenter | • Snabba mätningar • Detergentfria prover |
| Lowry Metod | 1-1500 μg/mL | • Väl etablerad • God känslighet | • Många störande ämnen • Flera steg | • Historisk konsistens • Rena proteinprover |
| UV Absorbans (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Icke-destruktiv • Mycket snabb • Inga reagenser behövs | • Påverkas av nukleinsyror • Kräver rena prover | • Rena proteinlösningar • Snabba kontroller under rening |
| Fluorometrisk | 0.1-500 μg/mL | • Högsta känslighet • Bred dynamisk räckvidd | • Dyra reagenser • Kräver fluorometer | • Mycket utspädda prover • Begränsad provvolym |
BCA (bicinchoninsyra) assay används främst för att kvantifiera den totala protein koncentrationen i ett prov. Det används i stor utsträckning inom biokemi, cellbiologi och molekylärbiologi för tillämpningar som western blotting, enzymatiska tester, immunprecipitation och proteinrening.
BCA-assayet är generellt noggrant inom 5-10% när det utförs korrekt. Dess noggrannhet beror på flera faktorer inklusive kvaliteten på standardkurvan, avsaknaden av störande ämnen och huruvida det okända proteinets sammansättning liknar det standardprotein som används.
Flera ämnen kan störa BCA-assayresultat, inklusive:
De huvudsakliga skillnaderna är:
Om din kalkylator visar en mycket stor provvolym indikerar det vanligtvis en låg protein koncentration i ditt prov. Detta kan bero på:
Överväg att koncentrera ditt prov eller justera din experimentdesign för att rymma den lägre protein koncentrationen.
Denna kalkylator är specifikt utformad för BCA-assayresultat. Även om den grundläggande principen (att konvertera koncentration till volym) gäller för andra metoder, varierar förhållandet mellan absorbans och protein koncentration mellan olika tester. För andra metoder som Bradford eller Lowry skulle du behöva använda olika standardkurveparametrar.
För absorbansavläsningar utanför det linjära intervallet (vanligtvis >2.0):
Bovin serumalbumin (BSA) är den mest använda standarden för BCA-assayer eftersom det är:
Men om dina prover innehåller ett dominerande protein som skiljer sig avsevärt från BSA, överväg att använda det proteinet som din standard för mer exakta resultat.
Den lila färgen som utvecklas i BCA-reaktionen är stabil i flera timmar vid rumstemperatur och kan mätas när som helst inom den perioden. För bästa resultat rekommenderas det att mäta alla standarder och prover vid ungefär samma tid efter färgutvecklingen.
Även om det tekniskt sett är möjligt att återanvända en standardkurva, rekommenderas det inte för noggrann kvantifiering. Variationer i reagenser, inkuberingsförhållanden och instrumentkalibrering kan påverka förhållandet mellan absorbans och protein koncentration. För pålitliga resultat, generera en ny standardkurva varje gång du utför assayet.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Instruktioner. Tillgänglig på: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Nu när du förstår principerna bakom BCA protein kvantifiering och provvolymberäkning, prova vår kalkylator för att strömlinjeforma ditt laboratoriearbetsflöde. Ange helt enkelt dina absorbansavläsningar och önskad provmassa för att få omedelbara, exakta provvolymberäkningar.
Oavsett om du förbereder prover för western blotting, enzymatiska tester eller någon annan proteinbaserad experiment, kommer vår kalkylator att hjälpa till att säkerställa konsekventa och pålitliga resultat. Spara tid, minska fel och förbättra reproducerbarheten av dina experiment med BCA Absorbans Volymberäknare för Prov.
Upptäck fler verktyg som kan vara användbara för din arbetsflöde