DNA Ligasyonu Hesaplayıcı - Moleküler Klonlama için İlave:Vektör Oranlarını Hesaplama

DNA ligasyonu, moleküler klonlamada bir ek parçasının T4 DNA ligaz enzimiyle bir plazmit vektöre bağlandığı adımdır. DNA ligasyonu hesaplayıcısı, reaksiyonun ek ile vektör arasında seçilen molar orana ulaşması için karıştırılacak ek DNA ve vektör DNA'sının mikrolitre cinsinden hacimlerini hesaplar.

Hesap makinesi ne yapar

Hesaplayıcı altı girdi alır: vektör derişimi, vektör uzunluğu, ek derişimi, ek uzunluğu, ekin vektöre hedef molar oranı ve toplam reaksiyon hacmi. Ayrıca kullanılacak vektör DNA'sı miktarının ayarlanmasına da olanak tanır; varsayılan değer 50 nanogramdır (ng). Bu değerlerden pipetlenmesi gereken vektör hacmini, pipetlenmesi gereken ek hacmini ve toplam reaksiyon hacmine ulaşmak için eklenecek tampon ya da su miktarını hesaplar.

Derişim, genellikle Nanodrop veya Qubit cihazından okunan, mikrolitre başına nanogram (ng/μL) cinsinden ölçülür. Uzunluk baz çifti (bp) cinsinden ölçülür. Bir kilobaz (kb), 1000 baz çiftine eşittir. Molar oran, her bir vektör molekülü için kaç ek molekülü bulunması gerektiğini ifade eder. Bu, kütle oranı değildir.

Neden kütle yerine molar oran kullanılır?

Eşit DNA kütleleri eşit sayıda molekül içermez. Kısa bir ek, aynı molekül sayısındaki uzun bir vektörden daha hafiftir. Kısa bir ek ile uzun bir vektörün eşit nanogram miktarlarını karıştırmak, vektör moleküllerine kıyasla çok az sayıda ek molekülü bırakır. Hesaplayıcı, ek kütlesini parça uzunluklarının oranına göre ayarlar; böylece son karışımda her bir vektör molekülü başına hedeflenen sayıda ek molekülü bulunur.

DNA ligasyonu formülü

Nanogram cinsinden gereken ek DNA miktarı şöyledir:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

burada $m_i$ ekin nanogram cinsinden miktarı, $m_v$ vektörün nanogram cinsinden miktarı, $k_i$ ekin kilobaz cinsinden uzunluğu, $k_v$ vektörün kilobaz cinsinden uzunluğu, R ise ekin vektöre hedef molar oranıdır.

Bu miktar belirlendikten sonra hesaplayıcı, her bir miktarı pipetlenebilir hacme dönüştürür:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

burada $V_v$ ve $V_i$ vektör ve ekin mikrolitre cinsinden hacimleri, $c_v$ ve $c_i$ vektör ve ekin mikrolitre başına nanogram cinsinden derişimleri, $V_b$ tampon hacmi, $V_t$ ise toplam reaksiyon hacmidir.

Vektör ve ek hacimleri birlikte toplam reaksiyon hacminden büyükse tampon, ligaz veya su için yer kalmaz. Bu durumda hesaplayıcı, negatif tampon miktarı göstermek yerine toplam hacmin çok küçük olduğunu bildirir.

Çözümlü örnek

Bir araştırmacı, 1 kb uzunluğundaki bir gen parçasını 3 kb uzunluğundaki bir plazmit vektöre klonlamaktadır. Plan, 50 ng vektör DNA'sını, ek:vektör molar oranı 3:1 olacak şekilde 20 μL hacmindeki bir reaksiyonda kullanmaktır.

Girdiler:

• Vektör derişimi: 50 ng/μL
• Vektör uzunluğu: 3000 bp (3 kb)
• Ek derişimi: 25 ng/μL
• Ek uzunluğu: 1000 bp (1 kb)
• Molar oran: 3
• Toplam hacim: 20 μL
• Vektör miktarı: 50 ng

Adım 1: ek miktarı

Ek miktarı (ng) = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Adım 2: hacimler

Vektör hacmi = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Ek hacmi = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Tampon hacmi = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reaksiyon; 1 μL vektör, 2 μL ek ve 17 μL tampon ya da sudan oluşur; ligaz ile reaksiyon tamponu da bu karışıma eklenir. Bu karışım, her bir vektör molekülü için üç ek molekülü sağlar.

Ligasyon için tipik molar oranlar

Yapışkan, çıkıntılı uçlar kullanan standart klonlamaların çoğunda 3:1 ek:vektör oranı kullanılır. Küt uçları birleştiren ligasyonlar daha az verimli olduğundan 5:1 gibi daha yüksek bir oran yaygındır. Çok büyük ekler bazen 1:1 oranına daha yakın, daha düşük bir oranla daha iyi sonuç verir; çünkü büyük parçalar molekül başına zaten çok sayıda baz çifti taşır.

Sık sorulan sorular

DNA ligasyonu nedir?

DNA ligasyonu, genellikle bir plazmit vektör ile bir ek olmak üzere iki DNA parçasının tek ve kesintisiz bir molekül hâlinde birleştirilmesidir. T4 DNA ligaz enzimi, parçaların uçları arasındaki bağlantıyı mühürler.

Ek:vektör molar oranı ne anlama gelir?

Bu oran, reaksiyonda her bir vektör molekülü için bulunan ek DNA molekülü sayısıdır. 3:1 oranı, kütleleri birbirine göre ne olursa olsun, her bir vektör molekülü için üç ek molekülü anlamına gelir.

Vektör ve ek için neden eşit nanogram miktarları kullanılmaz?

Farklı uzunluklardaki DNA parçalarının molekül başına kütleleri farklıdır. 1 kb uzunluğundaki bir ek, molekül başına 3 kb uzunluğundaki bir vektörün yaklaşık üçte biri kadar ağırdır. Her birinden eşit nanogram miktarı kullanılması eşit sayıda molekül vermez; bu nedenle hesaplayıcı, ek kütlesini hedef molar orana uyacak şekilde ayarlar.

Toplam hacmin çok küçük olması ne anlama gelir?

Bu, yalnızca vektör ve ek hacimlerinin tüm reaksiyon hacmini zaten doldurduğu ve tampon veya ligaz için yer kalmadığı anlamına gelir. Çözüm, toplam reaksiyon hacmini artırmak veya daha derişik DNA stokları kullanmaktır.

Bu hesaplayıcı Gibson Assembly veya Golden Gate klonlaması için kullanılabilir mi?

Hayır. Bu yöntemlerde farklı reaksiyon kimyası kullanılır ve genellikle sabit bir ek:vektör oranı yerine tüm parçaların eş molar miktarları hedeflenir. Hacim hesaplamaları standart T4 ligaz klonlamasından farklıdır.

Genellikle ne kadar vektör DNA'sı kullanılır?

50 ng, standart bir ligasyon reaksiyonu için yaygın bir başlangıç miktarıdır. Laboratuvarlar, DNA derişimine ve reaksiyonun ölçeğine göre ayarlayarak 25 ile 100 ng arasında miktarlar da kullanır.