qPCR Ефективност Калкулатор: Инструмент за Анализ на Стандартна Крива

Калкулатор за ефективност на qPCR

Калкулаторът за ефективност на qPCR оценява доколко добре реакцията на количествена PCR (qPCR) копира целевата ДНК последователност при всеки цикъл на амплификация. Той използва стойностите на Ct (номерът на цикъла, при който флуоресцентният сигнал пресича зададен праг) от серия разреждания, за да изчисли ефективността, наклона, свободния член и R².

Какво представлява ефективността на qPCR?

Количествената PCR проследява флуоресценцията, докато реакцията копира целева ДНК последователност цикъл по цикъл. Ефективността на амплификацията описва с колко нараства количеството целева ДНК при всеки цикъл. При ефективност 100% количеството целева ДНК се удвоява при всеки цикъл.

Реалните реакции рядко достигат точно 100%. Повечето лаборатории приемат ефективност между 90% и 110% като приемлива за надеждно количествено определяне. Стойност под 90% или над 110% насочва към проблем, например лош дизайн на праймерите, инхибитори на PCR, пренесени при екстракцията на пробата, или грешки при пипетиране в серията разреждания.

Ефективността е най-важна при сравняване на генната експресия между проби. Обичайният метод ΔΔCt за изчисляване на промяната в кратностите приема, че всяка реакция протича при ефективност 100%. Когато измерената ефективност се различава от 100% или когато целевият и референтният ген имат различни ефективности, резултатите за промяната в кратностите могат да бъдат неточни.

Формула за ефективност на qPCR

Ефективността се изчислява от наклона на стандартната крива — права, получена чрез нанасяне на стойностите на Ct спрямо десетичния логаритъм (log10) на количеството изходна ДНК в серия разреждания, с основа 10.

E = 10^(-1/наклон) - 1

E е ефективността, изразена като десетична дроб (умножава се по 100 за изразяване в проценти). Наклонът е наклонът на правата на стандартната крива. Той е отрицателен, тъй като Ct нараства с намаляването на количеството изходна ДНК.

Наклон -3,32 съответства на ефективност 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Това е така, защото десетократно разреждане 10 би трябвало да измести Ct с около 3,32 цикъла, ако реакцията удвоява ДНК при всеки цикъл, тъй като log2(10) е приблизително 3,32.

На практика наклон между -3,1 и -3,6 се счита за приемлив. Този диапазон съответства на ефективност приблизително от 90% до 110%. Наклон, по-близък до -3,1, дава по-висока изчислена ефективност, а наклон, по-близък до -3,6, дава по-ниска.

Как се изчислява ефективността на qPCR: метод на стандартната крива

1. Подгответе серия разреждания. Започнете с най-концентрираната проба и я разреждайте с постоянен коефициент, обикновено 10 пъти, за всяка следваща проба. Проведете qPCR за всяко разреждане и запишете стойността му на Ct.
2. Преобразувайте всяко разреждане в стойност на log10. Като означите първата, най-концентрирана проба с позиция 0, проба с номер i има log10 (относително количество), равно на -i × log10 (коефициента на разреждане).
3. Нанесете Ct (по вертикалната ос) спрямо стойността на log10 (по хоризонталната ос) за всяко разреждане и извършете линейна регресия.
4. Отчетете наклона, свободния член и R² на регресионната права.
5. Заместете наклона във формулата E = 10^(-1/наклон) - 1, за да получите ефективността.

Критерии за качеството на стандартната крива

• R² най-малко 0,98. Това измерва доколко точно точките се разполагат по права линия. По-ниска стойност често насочва към грешки при пипетиране или непостоянна амплификация.
• Наклон между -3,1 и -3,6. Този диапазон съответства на ефективност 90–110%.
• Най-малко три точки на разреждане. Пет или шест точки дават по-надеждна права и улесняват откриването на отклоняваща се стойност.
• Най-концентрираната проба трябва да даде Ct около 15-20. Най-разредената проба трябва да остане под Ct 35, тъй като стойности над него се доближават до границата на откриване.

Пример с решение

Серия от пет разреждания с коефициент 10 пъти дава следните стойности на Ct, от най-концентрираната към най-разредената проба: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Стойностите на log10 (относително количество) са 0, -1, -2, -3, -4, тъй като всяка стъпка на разреждане добавя -log10(10), или -1. Ct нараства с 3,5 цикъла при всяка стъпка, така че точките лежат на права линия и линейната регресия дава:

• Наклон: -3,5
• Свободен член: 15,0
• R²: 1,0

Ефективност: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, или около 93%.

Ефективност от 93% с R² = 1,0 отговаря на стандартните критерии за качество и е подходяща за количествено определяне на генната експресия.

Пример с код

Тази функция на JavaScript следва същия метод като калкулатора. Индексът на всяка стойност на Ct се обръща преди изчисляването на логаритъма, защото първата, най-концентрирана проба има най-голямо относително количество, а всяка следваща проба е по-разредена.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Защо ефективността е важна за генната експресия

Изчисленията на промяната в кратностите, включително методът ΔΔCt, приемат, че всяка реакция удвоява целевото количество при всеки цикъл. Когато целевият и референтният ген имат различни измерени ефективности, стандартната формула ΔΔCt внася грешка. Изследователите често преминават към изчисление с корекция за ефективността, например метода, описан от Michael Pfaffl през 2001, когато ефективностите се различават с повече от около пет процентни пункта. Насоките MIQE, широко цитирани стандарти за докладване на резултати от qPCR, публикувани през 2009, препоръчват изследванията да посочват изчислените ефективност, наклон и R² заедно с резултатите от количественото определяне.

Често задавани въпроси

Какъв е добрият процент ефективност на qPCR?

Обикновено се приема диапазонът между 90% и 110%, като добре оптимизираните анализи дават около 95–105%. Наклон -3,32 съответства точно на 100%.

Защо ефективността на моята qPCR е над 110%?

Честите причини включват грешки при пипетиране в серията разреждания, димеризация на праймерите, инхибитори, които влияят нееднакво на концентрираните и разредените проби, или флуоресцентен праг, зададен извън експоненциалната фаза на амплификацията. Крива на топене с повече от един пик може да насочва към димеризация на праймерите.

Защо ефективността на моята qPCR е под 90%?

Вероятните причини включват лош дизайн на праймерите, инхибитори на PCR, пренесени при екстракцията на пробата, или неоптимална температура на отгряване. Проверяването на специфичността на праймерите и провеждането на температурен градиент могат да помогнат за установяване на причината.

Какво означава ниска стойност на R²?

R² измерва доколко добре стойностите на Ct се разполагат по права линия спрямо логаритъма на количеството. Стойност под 0,98 предполага непостоянство при пипетиране, инхибирана проба или точка на разреждане близо до границата на откриване.

От колко точки на разреждане се нуждае стандартната крива?

Най-малко от три — минималният брой, необходим за линейна регресия. Пет или шест точки дават по-надежден наклон и улесняват откриването на отклоняващи се стойности.

Може ли ефективността да се променя между експериментите?

Да. Нова партида реагенти, нова партида праймери, различен вид проба или различен апарат за qPCR могат да променят ефективността. Много лаборатории проверяват повторно ефективността на всеки няколко месеца или при всяка нова партида реагенти.

Източници

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA и др. Насоките MIQE: минимална информация за публикуване на експерименти с количествена PCR в реално време. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Нов математически модел за относително количествено определяне при RT-PCR в реално време. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Доколко надеждна е оценката на ефективността на PCR: препоръки за прецизна и надеждна оценка на ефективността на qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.