Изчислете ефективността на PCR от стойности Ct и фактори на разреждане. Анализирайте стандартни криви, определете ефективността на амплификацията и валидирайте вашите количествени PCR експерименти.
Стойността трябва да бъде положителна
Стойността трябва да бъде положителна
Стойността трябва да бъде положителна
Стойността трябва да бъде положителна
Стойността трябва да бъде положителна
Въведете валидни данни, за да генерирате графика
Ефективността на qPCR е мярка за това колко добре работи PCR реакцията. Ефективност от 100% означава, че количеството на PCR продукта се удвоява с всеки цикъл по време на експоненциалната фаза.
Ефективността се изчислява от наклона на стандартната крива, която се получава чрез начертаване на Ct стойностите срещу логаритъма на началната концентрация на шаблона (серия от разреждания).
Ефективността (E) се изчислява с формулата:
E = 10^(-1/slope) - 1
Квантитативната полимеразна верижна реакция (qPCR) ефективността е критичен параметър, който пряко влияе на точността и надеждността на вашите qPCR експерименти. qPCR ефективност калькулаторът помага на изследователите да определят колко ефективно PCR реакциите усилват целевите ДНК последователности с всеки термален цикъл. Идеалните qPCR реакции трябва да имат ефективност между 90-110%, което показва, че количеството PCR продукт приблизително се удвоява с всеки цикъл по време на експоненциалната фаза.
Лошата amplificare ефективност може да доведе до неточна количествена оценка, ненадеждни резултати и погрешни експериментални заключения. Чрез изчисляване и наблюдение на вашата qPCR ефективност, можете да оптимизирате условията на реакцията, да валидирате дизайните на праймерите и да осигурите качеството на вашите количествени PCR данни.
Този калькулатор използва метода на стандартната крива, който чертае стойностите на цикловия праг (Ct) срещу логаритъма на концентрацията на шаблона (представен от серийни разреждания), за да определи ефективността на вашия qPCR тест. Полученият наклон на тази стандартна крива след това се използва за изчисляване на amplificare ефективността с помощта на проста математическа формула.
Ефективността на qPCR реакцията се изчислява от наклона на стандартната крива, използвайки следната формула:
Където:
За идеална PCR реакция с 100% ефективност (перфектно удвояване на ампликоните с всеки цикъл), наклонът би бил -3.32. Това е защото:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (или 100%)}
Процентът на ефективността се изчислява, като се умножи десетичната ефективност по 100:
\text{Ефективност (%)} = E \times 100\%
Стандартната крива се създава, като се чертаят стойностите на Ct (y-ос) срещу логаритъма на началната концентрация на шаблона или разреждане (x-ос). Връзката между тези променливи трябва да бъде линейна, а качеството на тази линейна връзка се оценява с помощта на коефициента на детерминация (R²).
За надеждни изчисления на qPCR ефективността:
Подготовка на данните: Калькулаторът приема вашите Ct стойности за всяка точка на разреждане и разреждането като входни данни.
Логаритмична трансформация: Серията на разреждане се трансформира в логаритмична скала (логаритъм на база 10).
Линейна регресия: Калькулаторът извършва линейна регресионен анализ на логаритмичните данни, за да определи наклона, y-пресечната точка и R² стойността.
Изчисление на ефективността: Използвайки стойността на наклона, ефективността се изчислява с формулата E = 10^(-1/slope) - 1.
Интерпретация на резултатите: Калькулаторът показва ефективността като процент, заедно с наклона и R² стойността, за да ви помогне да оцените надеждността на вашия qPCR тест.
Следвайте тези стъпки, за да изчислите вашата qPCR ефективност:
Настройте броя на разрежданията: Изберете колко точки на разреждане имате в стандартната крива (препоръчват се между 3-7 точки).
Въведете разреждането: Въведете разреждането, използвано между последователните проби (например, 10 за 10-кратно разреждане, 5 за 5-кратно разреждане).
Въведете Ct стойности: Въведете Ct стойностите за всяка точка на разреждане. Обикновено, първото разреждане (Разреждане 1) съдържа най-високата концентрация на шаблон, което води до най-ниската Ct стойност.
Прегледайте резултатите: Калькулаторът автоматично ще изчисли и покаже:
Интерпретирайте резултатите: Оценете дали вашата qPCR ефективност попада в приемливия диапазон (90-110%) и дали R² стойността показва надеждна стандартна крива (≥ 0.98).
Копирайте резултатите: Използвайте бутона "Копирай резултати", за да копирате всички изчислени стойности за вашите записи или публикации.
Нека преминем през пример:
Когато се начертае на стандартна крива:
Калькулаторът ще извърши линейна регресия и ще определи:
Използвайки формулата за ефективността:
Това показва добра qPCR ефективност от 93%, което попада в приемливия диапазон от 90-110%.
Преди да използвате нова двойка праймери за количествени експерименти, е важно да валидирате тяхната производителност. Изчисляването на qPCR ефективността помага:
Когато разработвате нови qPCR тестове, изчисленията на ефективността са критични за:
В експерименти за относителна количествена оценка, познаването на PCR ефективността е съществено за:
В клинични и диагностични условия, qPCR ефективността е важна за:
За приложения в околната среда и безопасността на храните, изчисленията на ефективността помагат:
Въпреки че методът на стандартната крива е най-често срещаният подход за изчисляване на qPCR ефективността, съществуват алтернативни методи:
Този метод изчислява ефективността от флуоресцентните данни на една амплификационна крива, без да изисква серия от разреждания. Софтуер като LinRegPCR анализира експоненциалната фаза на индивидуалните реакции, за да определи ефективността.
Предимства:
Недостатъци:
Цифровият PCR (dPCR) предоставя абсолютна количествена оценка без необходимост от стандартна крива или изчисления на ефективността.
Предимства:
Недостатъци:
Някои софтуерни програми за анализ на qPCR предлагат методи за сравнителна количествена оценка, които оценяват ефективността без пълна стандартна крива.
Предимства:
Недостатъци:
Развитието на qPCR и изчисленията на ефективността значително е еволюирало през последните няколко десетилетия:
Полимеразната верижна реакция (PCR) беше изобретена от Кари Мулис през 1983 г., революционизирайки молекулярната биология. Въпреки това, традиционната PCR беше само качествена или полуквантитативна. Първата система за реално време PCR беше разработена в началото на 90-те години от Ръсел Хигучи и колегите му, които демонстрираха, че мониторингът на PCR продуктите, докато те се натрупват (с помощта на флуоресценция на етидий бромид), може да предостави количествена информация.
С напредването на технологията qPCR, изследователите осъзнаха важността на стандартизацията и валидирането. Концепцията за PCR ефективност стана централна за надеждната количествена оценка:
Областта продължава да еволюира с:
Днес изчисляването и отчитането на qPCR ефективността се счита за съществено за публикуването на надеждни qPCR данни, а инструменти като този калькулатор помагат на изследователите да спазват най-добрите практики в областта.
1' Excel формула за изчисляване на qPCR ефективността от наклона
2' Поставете в клетка B2, ако наклонът е в клетка A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel формула за конвертиране на ефективността в процент
6' Поставете в клетка C2, ако десетичната ефективност е в клетка B2
7=B2*100
8
9' Функция за изчисляване на ефективността от Ct стойности и разреждане
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Изчисляване на линейна регресия
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Изчисляване на наклона
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Изчисляване на ефективността
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R функция за изчисляване на qPCR ефективността от Ct стойности и разреждане
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Създаване на лог разреждане
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Извършване на линейна регресия
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Извличане на наклона и R-квадрат
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Изчисляване на ефективността
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Връщане на резултатите
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Примерна употреба
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Ефективност: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Наклон: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-квадрат: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Изчисляване на qPCR ефективността от Ct стойности и разреждане.
8
9 Параметри:
10 ct_values (list): Списък на Ct стойности
11 dilution_factor (float): Разреждане между последователните проби
12
13 Връща:
14 dict: Речник, съдържащ ефективност, наклон, r_squared и y-пресечна точка
15 """
16 # Създаване на лог разреждане
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Извършване на линейна регресия
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Изчисляване на ефективността
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Начертаване на стандартната крива с регресионна линия.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Генериране на точки за регресионната линия
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Лог Разреждане')
48 plt.ylabel('Ct Стойност')
49 plt.title('qPCR Стандартна Крива')
50
51 # Добавяне на уравнение и R² към графиката
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Ефективност = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Примерна употреба
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Ефективност: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Наклон: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-квадрат: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Y-пресечна точка: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Начертаване на стандартната крива
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Изчисляване на qPCR ефективността от Ct стойности и разреждане
3 * @param {Array<number>} ctValues - Масив от Ct стойности
4 * @param {number} dilutionFactor - Разреждане между последователните проби
5 * @returns {Object} Обект, съдържащ ефективност, наклон, rSquared и y-пресечна точка
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Създаване на лог разреждане
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Изчисляване на средни стойности за линейна регресия
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Изчисляване на наклона и y-пресечната точка
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Изчисляване на R-квадрат
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Изчисляване на ефективността
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Примерна употреба
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Ефективност: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Наклон: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-квадрат: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Y-пресечна точка: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Добрата qPCR ефективност обикновено попада между 90% и 110% (0.9-1.1). Ефективността от 100% представлява перфектно удвояване на PCR продукта с всеки цикъл. Ефективности извън този диапазон могат да показват проблеми с дизайна на праймерите, условията на реакцията или наличието на инхибитори.
Ефективности над 100% могат да се появят поради:
Ниска R² стойност (под 0.98) предполага лоша линейност в стандартната крива, което може да бъде причинено от:
За надеждни изчисления на ефективността е необходим минимум от 3 точки на разреждане, но се препоръчват 5-6 точки за по-точни резултати. Тези точки трябва да обхващат целия динамичен диапазон на очакваните концентрации на шаблона в вашите експериментални проби.
В относителната количествена оценка, използваща метода ΔΔCt, се предполага, че целевите и референтните гени имат равни ефективности (идеално 100%). Когато ефективностите значително се различават:
Не, ефективността трябва да се определи за всяка двойка праймери и трябва да се валидира отново:
PCR инхибиторите могат да:
Термините често се използват взаимозаменяемо, но:
За да подобрите qPCR ефективността:
Не се препоръчва да се сравняват проби с значително различни ефективности, тъй като:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Нашият qPCR Ефективност Калькулатор предоставя прост, но мощен инструмент за изследователите да валидират и оптимизират своите количествени PCR експерименти. Чрез точно изчисляване на ефективността от стандартните криви, можете да осигурите надеждна количествена оценка, да отстраните проблемни тестове и да спазвате най-добрите практики в експериментирането с qPCR.
Опитайте нашия калькулатор днес, за да подобрите качеството и надеждността на вашите qPCR данни!
Открийте още инструменти, които може да бъдат полезни за вашия работен процес