Калкулатор за серийно разреждане - Лабораторен инструмент за концентрация

Калкулаторът за серийно разреждане определя концентрацията на дадено вещество при всяка стъпка от серията на разреждане. Серийното разреждане е лабораторна техника, при която концентрацията на разтвор се понижава чрез поредица от еднакви стъпки, като всяка нова стъпка разрежда предходната с един и същ коефициент.

Какво представлява серийното разреждане?

Серийното разреждане решава често срещан лабораторен проблем: пробата е твърде концентрирана, за да бъде измерена или използвана директно. Вместо да се измерва много малък обем с висок риск от грешка наведнъж, ученият разрежда пробата няколко пъти последователно, като при всяка стъпка използва малък и лесен за обработване обем.

Всяко разреждане започва от резултата на предходното, а не от първоначалната проба. Така се получава серия от концентрации, които всеки път намаляват с един и същ коефициент. Техниката се използва за преброяване на бактерии, за изследване на въздействието на лекарство върху клетки при различни дози, за изграждане на калибрационни криви за лабораторни анализи и за подготовка на ДНК проби за PCR.

Формула за серийно разреждане

Всяка стъпка на разреждане следва тази формула:

$C_2 = \frac{C_1}{DF}$

• C₁ е концентрацията преди стъпката
• DF е коефициентът на разреждане
• C₂ е концентрацията след стъпката

За да намерите концентрацията след няколко стъпки наведнъж, използвайте:

$C_n = \frac{C_0}{DF^n}$

• C₀ е началната концентрация
• DF е коефициентът на разреждане
• n е броят на стъпките
• C_n е концентрацията след n стъпки

Коефициентът на разреждане трябва да бъде по-голям от 1. Коефициент 1 би означавал, че изобщо няма разреждане. Началната концентрация трябва да бъде по-голяма от 0.

Този калкулатор приема от 1 до 20 стъпки и показва стъпка 0, тоест неразредената проба, заедно с тях. Единицата за концентрация е етикет в обикновен текст, например mg/mL или CFU/mL, и всеки ред се представя в същата единица. Концентрациите се показват с шест значими цифри, а стойностите под 0,000001 преминават към научен запис, така че малък резултат никога да не се показва като нула.

Коефициент на разреждане и съотношение на разреждане

Коефициентът на разреждане 10 често се записва като съотношение 1:10. Съотношението описва пропорции, а не самия коефициент: 1 част проба плюс 9 части разредител дават общо 10 части. Коефициентът показва колко пъти по-разреден е новият разтвор, така че съотношение 1:10 означава коефициент на разреждане 10, а не 11.

Често използвани коефициенти на разреждане:

• 10 (1:10): стандартният избор в микробиологията, тъй като обхваща широк диапазон от концентрации с малко стъпки.
• 2 (1:2): често се използва във фармакологията, където са необходими по-малки стъпки за построяване на крива доза–отговор.
• 5 (1:5): междинен вариант, който дава повече точки от 1:10, без да изисква толкова стъпки, колкото 1:2.

Пример: разреждане на бактериална култура

Течна култура съдържа приблизително 10⁸ колониеобразуващи единици (CFU) на милилитър, което е твърде висока концентрация за директно преброяване. За преброяването са необходими между 30 и 300 колонии на плака, затова пробата изисква серия 1:10 с 6 стъпки.

Посяването на 100 мкл (0,1 ml) от стъпка 5 поставя върху плаката приблизително 10² = 100 CFU, което е в диапазона за преброяване.

Пример: серия от двукратни разреждания на лекарство

Очаква се лекарството да има IC50 (концентрацията, която намалява активността наполовина) близо до 25 мг/mL. Изследването на диапазон около тази стойност изисква серия 1:2, започваща от 100 мг/mL, с 5 стъпки.

Тази серия обхваща очакваната стойност на IC50 и предоставя достатъчно точки за построяване на крива доза–отговор.

Как се извършва серийно разреждане

1. Преди началото надпишете всяка епруветка с номера на стъпката и коефициента на разреждане.
2. Добавете разредител във всяка епруветка, освен в тази, която съдържа първоначалната проба. При серия 1:10 добавете 9 обема разредител към 1 обем, който ще съдържа пробата.
3. Прехвърлете измерен обем от първоначалната проба в първата епруветка и разбъркайте старателно чрез вихрово смесване или чрез неколкократно пипетиране нагоре и надолу.
4. С нов накрайник прехвърлете същия обем от първата епруветка във втората и разбъркайте отново.
5. Повторете прехвърлянето и разбъркването за всяка от останалите епруветки.
6. Използвайте разредените проби своевременно, тъй като живите клетки продължават да растат, а някои съединения се разпадат с времето.

Приложения на серийното разреждане

В микробиологията серийното разреждане се използва за преброяване на бактериални колонии върху плаки и за определяне на минималната инхибираща концентрация (MIC), тоест най-ниската доза антибиотик, която спира бактериалния растеж. В биохимията то се използва за изграждане на стандартни криви за белтъчни анализи и за подготовка на ДНК матрици за PCR при работна концентрация. Във фармакологията сериите на разреждане се използват за изпитване на лекарства в диапазон от дози и за изчисляване на стойности като IC50. В имунологията те се използват за калибрационни криви при ELISA и за титруване на антитела, при което се определя най-високото разреждане, което все още дава положителен резултат.

Често срещани грешки

Недостатъчното разбъркване на всяка епруветка е честа причина за грешки, тъй като частиците и клетките могат да се утаят, вместо да останат равномерно разпределени. Повторното използване на пипетен накрайник може да пренесе достатъчно материал от по-концентрирана епруветка и да изкриви последващите измервания. Смесването на съотношението на разреждане с коефициента на разреждане води до неправилни обеми: разреждане 1:10 означава 1 част проба плюс 9 части разредител, а не 1 част плюс 10. Закръгляването на концентрацията при всяка стъпка, вместо директното изчисляване на крайната стойност от C₀/DF^n, може да натрупа забележима грешка след няколко стъпки.

История

Роберт Кох разработва количествени методи за преброяване на бактериални колонии през 1880-те години, докато изследва туберкулозата и холерата, като полага основите на метода за преброяване върху плака, който все още се използва. Въздушно-изместителната микропипета, изобретена от Хайнрих Шнитгер през 1957 г., по-късно позволява на изследователите да измерват точно микролитрови обеми, което прави фините и възпроизводими серии на разреждане практични за молекулярната биология и имуноанализите.

Често задавани въпроси

Как се изчислява серийно разреждане? Използвайте C_n = C₀ / DF^n, където C₀ е началната концентрация, DF е коефициентът на разреждане, а n е броят на стъпките. Например, 100 мг/mL, разредено с коефициент 10 за 3 стъпки, дава 100 / 10³ = 0,1 мг/mL.

Каква е разликата между коефициент на разреждане и съотношение на разреждане? Съотношението на разреждане, например 1:10, описва части: 1 част проба, смесена с 9 части разредител, дава 10 общо части. Коефициентът на разреждане е самото число 10, което означава, че разтворът е десет пъти по-малко концентриран.

Защо се използват няколко малки стъпки на разреждане вместо едно голямо разреждане? Малките прехвърляния с еднакъв обем се пипетират по-точно от едно много голямо разреждане. Серия от шест стъпки 1:10 също достига милионократно разреждане, което трудно се постига точно с една стъпка.

Колко точно е серийното разреждане? С калибрирани пипети и внимателна техника серията обикновено е точна в границите от 5 до 10 процента, което е подходящо за повечето микробиологични изследвания. Приложенията, които изискват по-висока точност, например фармацевтичните стандарти, често използват паралелни разреждания, направени директно от изходния разтвор.

Какъв е максималният полезен брой стъпки на разреждане? Този калкулатор допуска до 20 стъпки. В повечето лабораторни протоколи се използват 6 до 10 стъпки, тъй като грешката се натрупва с всяко допълнително прехвърляне. По-големият коефициент на разреждане намалява необходимия брой стъпки; например три стъпки с 1:100 достигат същото 10⁻⁶ разреждане като шест стъпки с 1:10.

Може ли коефициентът на разреждане да се променя между стъпките в една и съща серия? Да, но в повечето протоколи коефициентът остава постоянен, тъй като фиксираният коефициент се изчислява, пипетира и възпроизвежда по-лесно. Понякога се използва променлива серия, когато за една част от диапазона на концентрациите е необходима по-фина разделителна способност.