ДНК Лигация Калкулатор - Изчисляване на съотношения между Insert и Vector за Молекулно Клониране

Лигирането на ДНК е етапът в молекулярното клониране, при който вмъкнатият фрагмент се свързва с плазмиден вектор чрез ензима T4 ДНК лигаза. Калкулаторът за лигиране на ДНК изчислява колко микролитра ДНК на вмъкнатия фрагмент и векторна ДНК трябва да се смесят, за да достигне реакцията избрано моларно съотношение между вмъкнатия фрагмент и вектора.

Какво прави калкулаторът

Калкулаторът приема шест входни стойности: концентрация на вектора, дължина на вектора, концентрация на вмъкнатия фрагмент, дължина на вмъкнатия фрагмент, целево моларно съотношение между вмъкнатия фрагмент и вектора и общ обем на реакцията. Той позволява също да се зададе количеството векторна ДНК, което по подразбиране е 50 нанограма (ng). От тези стойности се изчисляват обемът вектор, който трябва да се пипетира, обемът вмъкнат фрагмент, който трябва да се пипетира, и количеството буфер или вода, което трябва да се добави за достигане на общия обем на реакцията.

Концентрацията се измерва в нанограми на микролитър (ng/μL), обикновено отчетени с уред Nanodrop или Qubit. Дължината се измерва в базови двойки (bp). Една килобаза (kb) се равнява на 1000 базови двойки. Моларното съотношение показва колко молекули от вмъкнатия фрагмент трябва да има на всяка една молекула вектор. То не е съотношение на маси.

Защо се използва моларно съотношение, а не маса

Равни маси ДНК не съдържат равен брой молекули. Кратък вмъкнат фрагмент тежи по-малко от дълъг вектор при еднакъв брой молекули. Смесването на равни количества в нанограми от кратък вмъкнат фрагмент и дълъг вектор би оставило твърде малко молекули от вмъкнатия фрагмент спрямо молекулите на вектора. Калкулаторът мащабира масата на вмъкнатия фрагмент според съотношението на дължините на фрагментите, така че крайната смес да съдържа предвидения брой молекули от вмъкнатия фрагмент на всяка молекула вектор.

Формула за лигиране на ДНК

Необходимото количество ДНК от вмъкнатия фрагмент, в нанограми, е:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

където $m_i$ е количеството на вмъкнатия фрагмент в нанограми, $m_v$ е количеството на вектора в нанограми, $k_i$ е дължината на вмъкнатия фрагмент в килобази, $k_v$ е дължината на вектора в килобази, а R е целевото моларно съотношение между вмъкнатия фрагмент и вектора.

След като това количество е известно, калкулаторът преобразува всяко количество в обем, подходящ за пипетиране:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

където $V_v$ и $V_i$ са обемите на вектора и вмъкнатия фрагмент в микролитри, $c_v$ и $c_i$ са концентрациите на вектора и вмъкнатия фрагмент в нанограми на микролитър, $V_b$ е обемът на буфера, а $V_t$ е общият обем на реакцията.

Ако обемите на вектора и вмъкнатия фрагмент заедно са по-големи от общия обем на реакцията, не остава място за буфер, лигаза или вода. В такъв случай калкулаторът показва, че общият обем е твърде малък, вместо да показва отрицателно количество буфер.

Пример с решение

Изследовател клонира генен фрагмент с дължина 1 kb в плазмиден вектор с дължина 3 kb. Планът е да се използват 50 нг векторна ДНК при моларно съотношение вмъкнат фрагмент:вектор 3:1 в реакция с обем 20 мкл.

Входни данни:

• Концентрация на вектора: 50 нг/микролитър
• Дължина на вектора: 3000 bp (3 kb)
• Концентрация на вмъкнатия фрагмент: 25 нг/микролитър
• Дължина на вмъкнатия фрагмент: 1000 bp (1 kb)
• Моларно съотношение: 3
• Общ обем: 20 мкл
• Количество вектор: 50 нг

Стъпка 1: количество на вмъкнатия фрагмент

ng от вмъкнатия фрагмент = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 нг

Стъпка 2: обеми

Обем на вектора = 50 нг ÷ 50 нг/микролитър = 1 мкл

Обем на вмъкнатия фрагмент = 50 нг ÷ 25 нг/микролитър = 2 мкл

Обем на буфера = 20 − 1 − 2 = 17 мкл

Реакцията се състои от 1 мкл вектор, 2 мкл вмъкнат фрагмент и 17 мкл буфер или вода; именно там се добавят и лигазата, и реакционният ѝ буфер. Тази смес дава три молекули от вмъкнатия фрагмент на всяка молекула вектор.

Типични моларни съотношения при лигиране

При повечето стандартни клонирания с лепкави, надвиснали краища се използва съотношение вмъкнат фрагмент:вектор 3:1. Лигирането на фрагменти с тъпи краища е по-неефективно, затова често се използва по-високо съотношение, например 5:1. При много големи вмъкнати фрагменти понякога работи по-добре по-ниско съотношение, по-близо до 1:1, тъй като големите фрагменти и без това съдържат много базови двойки на молекула.

Често задавани въпроси

Какво е лигиране на ДНК?

Лигирането на ДНК е свързването на два ДНК фрагмента, обикновено плазмиден вектор и вмъкнат фрагмент, в една непрекъсната молекула. Ензимът T4 ДНК лигаза запечатва връзката между краищата на фрагментите.

Какво означава моларното съотношение вмъкнат фрагмент:вектор?

Това е броят молекули ДНК от вмъкнатия фрагмент на всяка една молекула вектор в реакцията. Съотношение 3:1 означава три молекули от вмъкнатия фрагмент на всяка молекула вектор, независимо от съотношението между масите им.

Защо не се използват равни количества в нанограми от вектора и вмъкнатия фрагмент?

ДНК фрагментите с различна дължина имат различна маса на молекула. Вмъкнат фрагмент с дължина 1 kb тежи приблизително една трета от вектор с дължина 3 kb при сравнение на отделни молекули. Равни количества в нанограми от всеки от тях не биха дали равен брой молекули, затова калкулаторът коригира масата на вмъкнатия фрагмент, за да съответства на целевото моларно съотношение.

Какво означава, че общият обем е твърде малък?

Това означава, че само обемите на вектора и вмъкнатия фрагмент вече запълват целия обем на реакцията и не остава място за буфер или лигаза. Решението е да се увеличи общият обем на реакцията или да се използват по-концентрирани ДНК разтвори.

Може ли този калкулатор да се използва за клониране чрез Gibson Assembly или Golden Gate?

Не. Тези методи използват различна реакционна химия и обикновено целят еквимоларни количества от всички фрагменти, а не фиксирано съотношение вмъкнат фрагмент:вектор. Изчисленията на обемите при тях се различават от тези при стандартното клониране с T4 лигаза.

Какво количество векторна ДНК обикновено се използва?

50 нг е обичайно начално количество за стандартна реакция на лигиране. В лабораториите се използват и количества от 25 до 100 нг, съобразени с концентрацията на ДНК и мащаба на реакцията.