Калкулатор за концентрация на ДНК | Конвертор на A260 към ng/μL

Калкулатор за концентрация на ДНК

Калкулаторът за концентрация на ДНК преобразува показание за UV абсорбция при 260 нанометра, наречено A260, в концентрация на ДНК в нанограми на микролитър (ng/µL). Той показва и общото количество ДНК в пробата в микрограми (µg).

Какво представлява абсорбцията A260?

A260 е абсорбцията на ултравиолетова светлина от даден разтвор при дължина на вълната 260 нанометра. ДНК абсорбира UV светлина най-силно близо до тази дължина на вълната заради азотистите си бази. Спектрофотометърът измерва A260 след измерване на бланка, при което за отстраняване на фоновата абсорбция се използва същият буфер като при пробата. Колкото повече ДНК има в разтвора, толкова по-високо е показанието A260.

Формула за концентрацията на ДНК

Двуверижната ДНК абсорбира UV светлина пропорционално на концентрацията си — зависимост, известна като закон на Бер–Ламберт. При стандартен светлинен път от 1 сантиметър разтвор с показание A260 1,0 съдържа приблизително 50 нг/µL двуверижна ДНК. Това число, наречено коефициент на преобразуване, превръща всяко показание A260 в концентрация:

Концентрация на ДНК (ng/µL) = A260 × 50 × коефициент на разреждане

Коефициентът на разреждане отчита всяко разреждане, направено преди измерването на пробата. За проба, измерена без разреждане, коефициентът на разреждане е 1.

Как се изчислява общият добив на ДНК

След като концентрацията е известна, общата маса на ДНК в пробата може да се определи от нейния обем:

Общо количество ДНК (µg) = концентрация (ng/µL) × обем (µL) ÷ 1000

Как се изчислява концентрацията на ДНК: стъпка по стъпка

1. Разбъркайте добре пробата преди измерването. ДНК може да се задържи по стените на епруветката или да се разпредели неравномерно.
2. Разредете пробата, ако е силно концентрирана, като се стремите към показание A260 между 0,1 и 1,0. Показанията на спектрофотометъра са най-неточни извън този диапазон.
3. Нулирайте спектрофотометъра със същия буфер, използван за разреждането, след което измерете пробата при 260 нм.
4. Въведете показанието A260, обема на пробата и коефициента на разреждане в калкулатора, за да изчислите концентрацията и общия добив. И трите полета трябва да бъдат попълнени, а обемът трябва да е по-голям от нула, преди да се покаже резултат.

Пример с решение

Пример 1: неразредена проба

Показание A260 0,5, без разреждане (коефициент на разреждане 1) и обем на пробата 100 мкл.

• Концентрация = 0,5 × 50 × 1 = 25 нг/µL
• Общо количество ДНК = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 мкг

Пример 2: разредена проба

Епруветка съдържа 50 мкл пречистена ДНК. Малка част от нея е разредена 10 пъти, а разредената част дава показание A260 0,75. Коефициентът на разреждане преобразува това показание обратно до концентрацията в първоначалната епруветка, а 50 мкл е обемът, въведен в стъпката за изчисляване на общия добив.

• Концентрация = 0,75 × 50 × 10 = 375 нг/µL
• Общо количество ДНК = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 мкг

Изчисляване на коефициента на разреждане

Коефициент на разреждане = общ обем след разреждането ÷ обем на първоначалната проба.

Добавянето на 5 мкл разтвор на ДНК към 45 мкл буфер дава общ обем 50 мкл, така че коефициентът на разреждане е 50 ÷ 5 = 10. Проба, която не е разреждана, има коефициент на разреждане 1.

Типични диапазони на концентрацията на ДНК

Концентрацията зависи от вида на пробата и метода на екстракция. При екстракции на геномна ДНК концентрацията обикновено е приблизително между 10 и 100 нг/µL. При получаване на плазмидна ДНК често се достигат по-високи концентрации, понякога няколкостотин ng/µL. Резултат, който е значително извън очаквания диапазон за даден метод, може да насочи към проблем с екстракцията или със самото измерване.

Ограничения на измерването на UV абсорбцията

Измерването на A260 е бързо, но не е най-чувствителният или най-специфичният метод за ДНК. Протеините, РНК и някои компоненти на буфера също абсорбират светлина близо до 260 nm и могат да завишат показанието. Учените често проверяват съотношението A260/A280 заедно с концентрацията, за да установят наличие на протеиново замърсяване; съотношение около 1,8 обикновено показва чиста проба ДНК. Методите с флуоресцентни багрила, като анализите Qubit, се свързват само с двуверижна ДНК и дават по-точно показание при разредени или нечисти проби, но изискват допълнителни реактиви и флуорометър.

Често задавани въпроси

Как се изчислява концентрацията на ДНК от A260?

Умножете показанието A260 по 50, стандартния коефициент на преобразуване за двуверижна ДНК, след което умножете по коефициента на разреждане. Ако пробата не е била разреждана, използвайте коефициент на разреждане 1.

Какво е добро съотношение A260/A280?

Съотношение около 1,8 обикновено показва чиста проба ДНК. По-ниско съотношение подсказва наличие на протеиново замърсяване. Съотношение над 2,0 може да показва замърсяване с РНК.

Може ли този калкулатор да се използва за РНК?

Не пряко, тъй като за РНК се използва коефициент на преобразуване 40 нг/µL вместо 50. За оценка на концентрацията на РНК умножете резултата от калкулатора по 0,8 (40 ÷ 50) или използвайте директно A260 × 40 × коефициент на разреждане.

Защо показанието A260 трябва да бъде между 0,1 и 1,0?

Абсорбцията остава приблизително пропорционална на концентрацията, както е описано от закона на Бер–Ламберт, главно в този диапазон. Извън него показанията стават по-неточни, затова проба, която е прекалено концентрирана или прекалено разредена, трябва да се разреди или концентрира преди ново измерване.

Каква е разликата между концентрация и чистота?

Концентрацията измерва количеството ДНК, изразено в ng/µL. Чистотата показва доколко пробата е чиста и се оценява главно чрез съотношения на абсорбцията като A260/A280. Пробата може да има висока концентрация и въпреки това да е нечиста, или да има ниска концентрация и да е много чиста.

Как се преобразуват ng/µL в µg/mL?

Двете единици са числено равни. 1 нг/µL е равно на 1 мкг/mL, тъй като единицата за маса и единицата за обем се мащабират всяка с коефициент 1000.

Източници

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-то изд.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.