Калибровъчна крива Калкулатор | Линейна регресия за лабораторен анализ

Какво представлява калкулаторът на калибрационна крива

Калкулаторът на калибрационна крива преобразува показанията на уреда в концентрации. Той прави това, като прокарва права линия през точки от данни за стандарти с известна концентрация, след което използва тази линия, за да преобразува ново показание в концентрация. Лабораториите използват калибрационни криви в химията, биологията и изследванията на околната среда, когато уредът отчита сигнал, например абсорбанс или площ на пика, вместо директно да отчита концентрация.

Калкулаторът на тази страница прокарва права линия чрез линейна регресия, метода на най-малките квадрати. Той показва наклона, свободния член и R² — мярка за това колко близо до линията лежат точките. След това може да оцени концентрацията на неизвестна проба по измерен сигнал.

Формула на калибрационната крива

Калибрационната крива приема линейна зависимост между концентрацията и сигнала на уреда:

$y = mx + b$

• $y$ е сигналът (какво измерва уредът)
• $x$ е концентрацията
• $m$ е наклонът
• $b$ е свободният член

Как се изчисляват наклонът и свободният член

За множество от $n$ точки наклонът и свободният член, които най-добре съответстват на данните (по метода на най-малките квадрати), са:

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

Тук $\bar{x}$ и $\bar{y}$ са средната концентрация и средният сигнал за всички точки.

Формула за R²

R², коефициентът на детерминация, показва доколко добре правата съответства на данните:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ е сигналът, предсказан от правата за всяко $x_i$. R² варира от 0 до 1. Стойност 1 означава, че всяка точка лежи точно върху правата.

Формула за неизвестната концентрация

Щом наклонът и свободният член са известни, измереният сигнал $y$ може да се преобразува обратно в концентрация:

$x = \frac{y - b}{m}$

Ако изчислението даде отрицателно число, калкулаторът показва концентрацията като 0, тъй като отрицателна концентрация няма физически смисъл.

Пример с изчисление

Нека четири стандарта дадат следните резултати:

Средната концентрация е 3, а средният сигнал е 0,20.

Наклон:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

Свободен член:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

R²: сравнението на предсказаните сигнали с действителните дава R² = 0,9966.

Напаснатата права е:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

Сега нека неизвестна проба даде сигнал 0,20. Нейната концентрация е:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

Как се използва този калкулатор

1. Въведете известната концентрация на всеки стандарт и измерения му сигнал като двойка числа. Калкулаторът започва с два реда.
2. Изберете „Добавяне на точка от данни“, за да въведете още стандарти, или „Премахване на точка от данни“ до даден ред, за да го изтриете. Необходими са поне две точки.
3. Щом са попълнени поне две точки, калкулаторът показва уравнението на регресията, стойността на R² и графика на точките с построената линия.
4. Въведете измерен сигнал в полето „Изчисляване на неизвестна концентрация“, за да видите съответстващата концентрация. Тя се актуализира автоматично при въвеждане на стойността; не е необходимо да натискате отделен бутон.
5. Изберете „Нулиране“, за да изтриете всички въведени точки и полето за сигнала и да започнете отначало.

Тълкуване на наклона, свободния член и R²

Наклонът показва с колко се променя сигналът при единица промяна на концентрацията. По-големият наклон означава, че методът реагира силно на малки промени в концентрацията.

Свободният член е предсказаният сигнал при нулева концентрация. Той отразява фоновия сигнал, например от празна проба или базовата линия на уреда. Ненулевият свободен член е често срещан и не е непременно проблем, но голям или непостоянен свободен член между отделни калибрирания може да насочва към замърсяване или повреда на уреда.

R² показва доколко близо точките следват права линия. Стойности над 0,99 са типични за добре работещ линеен метод. По-ниско R² може да означава грешка при пипетиране, влошен стандарт или диапазон от концентрации, в който сигналът вече не е линеен.

Къде се използват калибрационните криви

Калибрационните криви са често използвани навсякъде, където суровият сигнал на уреда трябва да бъде преобразуван в концентрация:

• Спектрофотометрия — измерва се абсорбансът на светлината и се преобразува в концентрация, например при измерване на съдържанието на протеин или пигмент.
• Хроматография (HPLC, GC) — площта или височината на пика от хроматограма се преобразува в концентрация; това е обичайно при изследване на лекарства и анализ на околната среда.
• ELISA и други имуноанализи — интензитетът на цвета или флуоресценцията от планшетен четец се преобразува в концентрация на антиген или антитяло.
• qPCR — стойностите на праговия цикъл (Ct) от серийни разреждания на проба с известен състав изграждат крива, използвана за оценка на количеството генетичен материал в неизвестна проба.

Кога правата линия не е подходяща

Някои методи не са линейни в целия си диапазон. Обичайните решения включват ограничаване на калибрирането до по-тесен линеен участък, прилагане на логаритмично преобразуване преди напасването на права, използване на полиномиално напасване (крива) или използване на претеглена регресия, когато грешката на измерване нараства или намалява с концентрацията. Този калкулатор напасва само права; ако точките явно образуват крива, резултатите ще бъдат по-ненадеждни и може да е необходим друг модел.

Често задавани въпроси

Какво представлява калибрационната крива?

Калибрационната крива е права, напасната към показанията на уреда за проби с известна концентрация. Тя се използва за преобразуване на ново показание от проба с неизвестна концентрация в стойност на концентрацията.

От колко точки от данни се нуждае калибрационната крива?

За да напасне права, калкулаторът се нуждае от поне две точки, но две точки не могат да покажат дали действителната зависимост е права. Повечето лаборатории използват от пет до осем стандарта, обхващащи очаквания диапазон на неизвестните проби.

Какво означава R² в калибрационната крива?

R² измерва доколко близо точките от данни следват напаснатата права по скала от 0 до 1. Стойност 1 означава, че всяка точка лежи точно върху правата. Стойности над 0,99 обикновено се приемат като силно доказателство за линейна зависимост.

Може ли концентрациите да се оценяват извън диапазона на стандартите?

Оценяването на концентрация под най-ниския стандарт или над най-високия стандарт е ненадеждно, тъй като няма данни, потвърждаващи, че правата остава права там. По-добре е проба с прекалено висок сигнал да се разреди, а проба с прекалено нисък сигнал да се концентрира, след което да се измери отново в рамките на калибрирания диапазон.

Защо изчислената концентрация понякога се показва като 0?

Ако измереният сигнал е по-нисък от свободния член на построената линия (при положителен наклон), формулата $x = (y - b) / m$ дава отрицателно число. В такъв случай калкулаторът показва 0, тъй като реалната концентрация не може да бъде отрицателна.

Каква е разликата между наклона и свободния член?

Наклонът описва чувствителността на сигнала към промяна в концентрацията. Свободният член е сигналът, предсказан при нулева концентрация, който често отразява фоновия сигнал, а не самото анализирано вещество.

Източници

1. National Institute of Standards and Technology. NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods, 4.1.4.1: Linear Least Squares Regression. NIST: линейна регресия по метода на най-малките квадрати — параметрите се оценяват чрез минимизиране на сумата от квадратите на отклоненията между данните и линията.
2. National Institute of Standards and Technology. NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods, 4.5.2.1: Single-Use Calibration Intervals. NIST: калибриране за еднократна употреба — новият сигнал се приравнява на построената линия и се решава спрямо неизвестното, x = (y − b) ÷ m за права линия.