Калкулатор на закона на Бер-Ламберт - Мигновено изчисляване на абсорбцията

Какво представлява законът на Бер–Ламберт?

Законът на Бер–Ламберт е формула, която описва колко светлина поглъща даден разтвор. Той свързва абсорбцията с три неща: концентрацията на разтвора, силата, с която разтвореното вещество поглъща светлина, и разстоянието, което светлината изминава през пробата. Нарича се също закон на Бер. Калкулаторът за закона на Бер–Ламберт прилага тази формула, за да определи абсорбцията, пропускливостта и процента погълната светлина от няколко прости входни данни.

Законът е основен инструмент в спектроскопията — изследването на начина, по който веществата поглъщат и излъчват светлина. Той се използва ежедневно в химични, биологични и медицински лаборатории за измерване на концентрацията на вещества в разтвор.

Формула на закона на Бер–Ламберт

Законът на Бер–Ламберт гласи:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A е абсорбцията — количеството светлина, което разтворът поглъща при дадена дължина на вълната. Тя няма мерни единици.
• ε (епсилон) е моларният коефициент на поглъщане, наричан също моларен коефициент на екстинкция. Той измерва колко силно дадено вещество поглъща светлина при определена дължина на вълната. Мерни единици: L/(mol·cm).
• c е концентрацията на веществото в mol/L (моларност).
• l е дължината на оптичния път — разстоянието, което светлината изминава през пробата, в cm.

Абсорбцията е свързана с пропускливостта — частта от светлината, която преминава през пробата:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

Тук T е пропускливостта — число между 0 и 1. Умножаването на T по 100 дава процента пропусната светлина. Процентът погълната светлина е:

$\text{Процент погълната светлина} = (1 - T) \times 100\%$

Например абсорбция от 1,0 означава T = 0,1, така че 90% от светлината е погълната. Абсорбция от 2,0 означава T = 0,01, така че са погълнати 99%.

Как се изчислява абсорбцията

За да определите абсорбцията с калкулатора, въведете три стойности:

1. Дължина на оптичния път (l) — ширината на съда за пробата, обикновено кювета. Повечето стандартни кювети са широки 1 cm, но някои специализирани са с ширина 0,1 cm или 10 cm.
2. Моларен коефициент на поглъщане (ε) — свойство на конкретното вещество при определена дължина на вълната. Обикновено се намира в публикувани справочни таблици или се изчислява от структурата на молекулата. Например белтъците поглъщат светлина около 280 nm заради две аминокиселини — триптофан и тирозин, а точната стойност зависи от броя на тези аминокиселини в белтъка.
3. Концентрация (c) — количеството разтворено вещество в mol/L. Концентрациите, дадени в други единици, например mg/mL, трябва първо да се преобразуват чрез моларната маса на молекулата.

Калкулаторът умножава трите числа, за да получи абсорбцията, след което изчислява пропускливостта и процента погълната светлина въз основа на този резултат.

Пример с решение

Изследовател пречиства белтък и трябва да провери концентрацията му, преди да проведе експеримент. Моларният коефициент на поглъщане на белтъка при 280 nm е известен от аминокиселинната му последователност: ε = 44 000 l/(mol·cm). Изследователят измерва пробата в стандартна кювета с дължина на оптичния път 1 cm и отчита абсорбция A = 0,523.

Преобразуване на формулата за намиране на концентрацията:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

Това е 11,9 микромола на литър (μM). Стойността попада в диапазона, в който уредите отчитат най-точно, така че изследователят може да ѝ се довери, без да разрежда допълнително пробата.

Тълкуване на стойностите на абсорбцията

• A = 0: при тази дължина на вълната не се поглъща светлина.
• A = 0,3 до 0,9: диапазонът, в който повечето спектрофотометри дават най-точни и линейни показания.
• A = 1,0: погълнати са 90% от светлината, а 10% са пропуснати.
• A = 2,0: погълнати са 99%, а 1% са пропуснати.
• A над 2,5: извън надеждния диапазон на повечето уреди. Пробата трябва да се разреди и да се измери повторно.

Показанията под около 0,3 се влияят от шума на уреда. Показанията над около 1,5 се влияят от малки количества разсеяна светлина вътре в уреда, което води до грешка. Разреждането на пробата и повторното измерване е стандартното решение, когато показанието е извън точния диапазон.

Приложения на закона на Бер–Ламберт

Аналитична химия. Лабораториите измерват абсорбцията на проба и използват формулата, за да изчислят обратно неизвестна концентрация. Това се прави често при изследване на нивата на нитрати, фосфати и метални йони във вода, както и при проверка на концентрацията на химична партида по време на производство.

Биохимия. Абсорбцията при 280 nm се използва за оценка на концентрацията на белтъци. Абсорбцията при 260 nm се използва за оценка на концентрацията на ДНК или РНК; по конвенция абсорбция от 1,0 съответства приблизително на 50 мкг/mL двуверижна ДНК или 40 мкг/mL РНК. Съотношението на двете показания (A260/A280) дава приблизителна оценка на чистотата на пробата.

Фармацевтика. Производителите на лекарства използват показанията за абсорбция, за да проверят колко бързо таблетка освобождава активното си вещество и да проследят как лекарството се разгражда с течение на времето при съхранение.

Медицина. Много автоматизирани анализатори за кръвни изследвания измерват абсорбцията при цветни химични реакции, за да определят нивата на глюкоза, чернодробни ензими и билирубин.

Храни и напитки. Цветът на бирата се измерва чрез абсорбция при 430 nm по метода на Европейската конвенция за пивоварство (EBC). Подобни методи се използват за проверка на цвета на вино и безалкохолни напитки.

Ограничения на закона на Бер–Ламберт

Законът приема, че светлината е с една-единствена, точно определена дължина на вълната и че пробата не разсейва светлината. Той не е приложим напълно в няколко често срещани ситуации:

• Висока концентрация. Над приблизително 0,01 mol/L разтворените молекули започват да си взаимодействат и абсорбцията вече не расте по права линия с концентрацията.
• Мътни проби или проби с частици. Суспензиите и мътните течности разсейват светлината, освен че я поглъщат, което завишава отчетената абсорбция. Законът на Бер–Ламберт не отчита разсейването; за непрозрачни или разсейващи проби, например прахове, се използва свързан модел, наречен теория на Кубелка–Мунк.
• Химични промени по време на измерването. Някои вещества се разграждат под въздействието на светлината или се променят при промяна на pH по време на измерването, което променя показанието в хода на анализа.
• Промени в температурата. Моларният коефициент на поглъщане зависи от температурата, затова показанията, получени при несъгласувани температури, не могат да се сравняват пряко.

История

Законът се е оформял повече от век чрез труда на трима учени. Пиер Бугер е описал през 1729 г., че всеки равен слой от даден материал поглъща равен дял от преминаващата през него светлина. Йохан Хайнрих Ламберт е формулирал тази зависимост математически в книгата си Photometria от 1760 г. и е показал, че абсорбцията расте право пропорционално на дължината на оптичния път. Август Бер е разширил закона през 1852 г. и е показал, че абсорбцията расте право пропорционално и на концентрацията. Обединеният закон понякога се нарича закон на Бугер–Бер–Ламберт в знак на признание към тримата.

Често задавани въпроси

За какво се използва законът на Бер–Ламберт? Той изчислява колко светлина поглъща даден разтвор и работи в обратна посока, за да определи неизвестна концентрация от измерена абсорбция. Това го превръща в основа на UV-Vis спектрофотометрията — широко използван лабораторен метод за измерване на количеството вещество в разтвор.

Какви единици използва законът на Бер–Ламберт? Дължината на оптичния път се измерва в сантиметри, моларният коефициент на поглъщане — в L/(mol·cm), а концентрацията — в mol/L. Самата абсорбция няма мерни единици, въпреки че понякога се означава с „AU“ за единици на абсорбция. Използването на други единици във формулата без предварително преобразуване води до грешен резултат.

Защо показанието за абсорбция не е пропорционално на концентрацията? Най-честите причини са концентрация над около 0,01 mol/L, мътна проба или проба с частици, или показание далеч извън диапазона 0,3–0,9, в който уредите са най-точни. Разреждането на пробата и повторното измерване обикновено показват коя причина е налице.

Каква е разликата между абсорбция и пропускливост? Пропускливостта е частта от светлината, която преминава през пробата. Абсорбцията е отрицателният логаритъм с основа 10 на пропускливостта: A = −log₁₀(T). С нарастването на абсорбцията пропускливостта намалява.

Каква е разликата между абсорбция и оптична плътност? Това е една и съща величина. Терминът „оптична плътност“ се използва по-често в биологията, докато „абсорбция“ е по-разпространен в химията.

Кой диапазон на абсорбция е най-точен? Приблизително от 0,3 до 0,9. Под този диапазон шумът на уреда доминира над сигнала. Над около 1,5 разсеяната светлина вътре в уреда внася грешка, а над около 2,5 повечето уреди изобщо не могат да дадат надеждно показание.

Източници

1. Technische Universität Braunschweig, Institute of Physical and Theoretical Chemistry. Beer-Lambert Law. TU Braunschweig, закон на Бер–Ламберт — A = ε × b × c, където ε е в M⁻¹ cm⁻¹; A = −log(T); нелинейност при високи концентрации (>0,01 M), разсейване и паразитна светлина.
2. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., & Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure. ChemPhysChem 21(18), 2020, свободен достъп чрез PubMed Central. Mayerhöfer et al. 2020 (PMC) — името закон на Бугер–Бер–Ламберт и ролите на Бугер, Ламберт и Бер (Beer, Ann. Phys., 1852).