Kalkulátor koncentrace proteinu | A280 na mg/mL

Kalkulátor koncentrace bílkovin

Kalkulátor koncentrace bílkovin převádí měření absorbance světla ze spektrofotometru na množství bílkoviny rozpuštěné v roztoku. Výsledek se obvykle uvádí v miligramech na mililitr (mg/ml) nebo mikrogramech na mililitr (μg/ml). Výpočet vychází z Beerova-Lambertova zákona, vztahu v chemii, který propojuje množství světla absorbovaného vzorkem s množstvím obsažené látky.

Jak se měří koncentrace bílkovin

Většina bílkovin silně absorbuje ultrafialové světlo o vlnové délce 280 nanometrů (nm). Tato absorpce je způsobena především dvěma aminokyselinami, tryptofanem a tyrosinem, které se nacházejí ve struktuře bílkoviny. Spektrofotometr prosvítí vzorek světlem a měří, jaké množství světla vzorek absorbuje. Toto měření se nazývá absorbance neboli A280, pokud se provádí při 280 nm.

Měření absorbance při 280 nm je rychlé a vzorek při něm není zničen. Tím se liší od chemických metod, jako jsou Bradfordova nebo BCA metoda popsané níže. Metoda nejlépe funguje u purifikované bílkoviny v roztoku s absorbancí přibližně mezi 0,1 a 1,0. Měření mimo tento rozsah jsou méně spolehlivá, takže vzorek je často před měřením nutné naředit.

Vzorec pro koncentraci bílkovin

Kalkulátor upravuje Beerův-Lambertův zákon tak, aby vypočítal koncentraci:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — koncentrace bílkoviny v mg/ml
• A — absorbance při 280 nm (prosté číslo bez jednotky)
• DF — faktor ředění, tedy kolikrát byl původní vzorek před měřením naředěn
• ε — extinkční koeficient, konstanta specifická pro danou bílkovinu, v L/(g·cm)
• l — délka optické dráhy, vzdálenost, kterou světlo prochází vzorkem, v cm (ve standardní kyvetě, malé skleněné nebo plastové nádobce používané ve spektrofotometru, obvykle 1 cm)

Chcete-li výsledek převést na mikrogramy na mililitr, vynásobte hodnotu v mg/ml číslem 1 000. Celkovou hmotnost bílkoviny ve vzorku získáte vynásobením koncentrace objemem vzorku v mililitrech.

Příklad výpočtu

Vzorek má absorbanci 0,5 při 280 nm. Nebyl naředěn, takže faktor ředění je 1, a měření proběhlo ve standardní kyvetě o délce 1 cm. Bílkovinou je bovinní sérový albumin (BSA), který má extinkční koeficient 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/ml

Ve vzorku o objemu 1 mL je tedy přibližně 0,75 mg celkové bílkoviny neboli 750 μg/ml.

Extinkční koeficienty běžných bílkovin

Každá bílkovina absorbuje světlo jinak, protože obsahuje jiný počet zbytků tryptofanu a tyrosinu. Extinkční koeficient tento rozdíl popisuje pro konkrétní bílkovinu při 280 nm v jednotkách L/(g·cm). Mezi běžně používané hodnoty patří:

Kalkulátor může přijmout také vlastní extinkční koeficient pro bílkovinu, která na tomto seznamu není. U bílkoviny se známou sekvencí aminokyselin lze tuto hodnotu odhadnout pomocí vzorce, který Gill a von Hippel publikovali v roce 1989: ε₂₈₀ = (zbytky tryptofanu × 5 500) + (zbytky tyrosinu × 1 490) + (zbytky cystinu × 125). Tento vzorec poskytuje výsledek v M⁻¹cm⁻¹, molární jednotce, která se liší od výše uvedených hmotnostních hodnot v L/(g·cm). Bezplatné nástroje, jako je ProtParam provozovaný serverem ExPASy, vypočítají tuto hodnotu přímo ze sekvence bílkoviny.

Délka optické dráhy a faktor ředění

Délka optické dráhy je šířka kyvety obsahující vzorek, měřená v centimetrech. Standardní kyvety jsou široké 1 cm. Mikroobjemové spektrofotometry, které měří velmi malé vzorky, mohou používat mnohem kratší optickou dráhu, například 0,1 cm.

Faktor ředění zohledňuje jakékoli ředění provedené před měřením. Pokud by koncentrovaný vzorek měl absorbanci vyšší než 1,0, běžně se nejprve ředí pufrem. Faktor ředění se rovná celkovému objemu naředěného vzorku dělenému původním objemem vzorku. Například smícháním 10 μL vzorku s 990 μL pufru vznikne celkový objem 1 000 μL a faktor ředění 100.

Jiné způsoby měření koncentrace bílkovin

Absorbance při 280 nm je jednou z několika běžných metod používaných v laboratoři.

• Bradfordova metoda: používá barvivo, které po navázání na bílkovinu změní barvu. Dobře funguje u nepurifikovaných vzorků, ale změna barvy se může u různých bílkovin lišit.
• BCA metoda: využívá změnu barvy způsobenou peptidovými vazbami bílkoviny. Je kompatibilní s mnoha detergenty, ale její provedení trvá déle než přímé měření absorbance.
• Lowryho metoda: starší metoda, která je velmi citlivá, ale špatně reaguje s některými běžnými složkami pufrů.

Každá z těchto tří metod vzorek zničí. Přímé měření A280 nikoli, takže tentýž vzorek lze získat zpět a znovu použít.

Často kladené otázky

Jaký je ideální rozsah absorbance pro tuto metodu?

Mezi 0,1 a 1,0. Pod 0,1 je měření nepřesné. Nad 1,0 již vztah mezi absorbancí a koncentrací nemusí být lineární, takže vzorek je třeba nejprve naředit.

Proč se měří při 280 nm místo při 260 nm?

Nukleové kyseliny, například DNA a RNA, silně absorbují při 260 nm. Bílkoviny absorbují více při 280 nm díky obsahu tryptofanu a tyrosinu. Měření při 280 nm omezuje rušení způsobené nukleovými kyselinami přítomnými ve vzorku.

Jak se určuje extinkční koeficient bílkoviny, která není na seznamu?

U bílkoviny se známou sekvencí jej nástroj, jako je ProtParam, vypočítá z počtu zbytků tryptofanu, tyrosinu a cystinu. Lze jej také změřit přímo porovnáním absorbance vzorku s roztokem o známé koncentraci.

Funguje tato metoda pro směs bílkovin?

Nejlépe funguje u jediné purifikované bílkoviny se známým extinkčním koeficientem. Směs neznámých bílkovin, například buněčný lyzát, se obvykle měří Bradfordovou nebo BCA metodou, protože tyto metody poskytují konzistentnější odhad celkového množství bílkovin.

Mohou detergenty ovlivnit měření?

Ano. Mnoho detergentů absorbuje světlo v blízkosti 280 nm, což může zkreslit výsledek. Použití slepého vzorku obsahujícího stejnou koncentraci detergentu pomáhá odečíst tuto absorpci pozadí. Velmi vysoké koncentrace detergentů mohou vyžadovat metodu kompatibilní s detergenty, například BCA.