Výpočet Beer-Lambertova zákona - Okamžitý výpočet absorbance

Co je Beerův-Lambertův zákon?

Beerův-Lambertův zákon je vzorec popisující, kolik světla roztok absorbuje. Absorbanci spojuje se třemi faktory: s koncentrací roztoku, se schopností rozpuštěné látky absorbovat světlo a s délkou dráhy, kterou světlo prochází vzorkem. Nazývá se také Beerův zákon. Kalkulačka Beerova-Lambertova zákona používá tento vzorec k výpočtu absorbance, transmitance a procenta absorbovaného světla z několika jednoduchých vstupních údajů.

Zákon je základním nástrojem spektroskopie, oboru studujícího, jak látky absorbují a vyzařují světlo. Každý den se používá v chemických, biologických a lékařských laboratořích k měření koncentrace látek v roztoku.

Vzorec Beerova-Lambertova zákona

Beerův-Lambertův zákon říká:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A je absorbance, tedy množství světla, které roztok absorbuje při dané vlnové délce. Nemá žádné jednotky.
• ε (epsilon) je molární absorpční koeficient, nazývaný také molární extinkční koeficient. Udává, jak silně látka absorbuje světlo při určité vlnové délce. Jednotky: L/(mol·cm).
• c je koncentrace látky v mol/L (molární koncentrace).
• l je délka optické dráhy, tedy vzdálenost, kterou světlo prochází vzorkem, v cm.

Absorbance souvisí s transmitancí, tedy podílem světla, které projde vzorkem:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

Zde T označuje transmitanci, což je číslo mezi 0 a 1. Vynásobením T hodnotou 100 získáme procento prošlého světla. Procento absorbovaného světla je:

$\text{Procento absorbovaného světla} = (1 - T) \times 100\%$

Například absorbance 1,0 znamená T = 0,1, takže bylo absorbováno 90 % světla. Absorbance 2,0 znamená T = 0,01, takže bylo absorbováno 99 % světla.

Jak vypočítat absorbanci

Chcete-li pomocí kalkulačky zjistit absorbanci, zadejte tři hodnoty:

1. Délka optické dráhy (l) — šířka nádoby se vzorkem, obvykle kyvety. Většina standardních kyvet má šířku 1 cm, některé specializované kyvety však mají 0,1 cm nebo 10 cm.
2. Molární absorpční koeficient (ε) — vlastnost konkrétní látky při konkrétní vlnové délce. Obvykle se hledá v publikovaných referenčních tabulkách nebo se vypočítá ze struktury molekuly. Například proteiny absorbují světlo kolem 280 nm v důsledku přítomnosti dvou aminokyselin, tryptofanu a tyrosinu, přičemž přesná hodnota závisí na jejich počtu v daném proteinu.
3. Koncentrace (c) — množství rozpuštěné látky v mol/L. Koncentrace uvedené v jiných jednotkách, například v mg/mL, je nejprve nutné převést pomocí molární hmotnosti molekuly.

Kalkulačka vynásobí tři hodnoty a získá absorbanci, poté z tohoto výsledku odvodí transmitanci a procento absorbovaného světla.

Příklad výpočtu

Výzkumník přečistí protein a potřebuje před provedením experimentu ověřit jeho koncentraci. Molární absorpční koeficient proteinu při 280 nm je znám z jeho sekvence: ε = 44 000 L/(mol·cm). Výzkumník změří vzorek ve standardní kyvetě o délce 1 cm a naměří absorbanci A = 0,523.

Úpravou vzorce pro výpočet koncentrace:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

To odpovídá 11,9 mikromolární koncentraci (μM). Tato hodnota spadá do rozsahu, v němž přístroje měří nejpřesněji, takže výzkumník může výsledku důvěřovat, aniž by vzorek dále ředil.

Interpretace hodnot absorbance

• A = 0: při této vlnové délce nebylo absorbováno žádné světlo.
• A = 0,3 až 0,9: rozsah, v němž většina spektrofotometrů poskytuje nejpřesnější lineární měření.
• A = 1,0: 90 % světla bylo absorbováno, 10 % prošlo.
• A = 2,0: 99 % světla bylo absorbováno, 1 % prošlo.
• A vyšší než 2,5: hodnota je mimo spolehlivý rozsah většiny přístrojů. Vzorek je třeba zředit a znovu změřit.

Hodnoty pod přibližně 0,3 jsou ovlivněny šumem přístroje. Hodnoty nad přibližně 1,5 jsou ovlivněny malým množstvím rozptýleného světla uvnitř přístroje, které způsobuje chybu. Pokud měření leží mimo přesný rozsah, standardním řešením je vzorek zředit a znovu změřit.

Kde se Beerův-Lambertův zákon používá

Analytická chemie. Laboratoře měří absorbanci vzorku a pomocí vzorce zpětně vypočítávají neznámou koncentraci. Běžně se tak stanovují hladiny dusičnanů, fosforečnanů a iontů kovů ve vodě a kontroluje koncentrace chemické šarže během výroby.

Biochemie. Absorbance při 280 nm slouží k odhadu koncentrace proteinů. Absorbance při 260 nm odhaduje koncentraci DNA nebo RNA; podle konvence odpovídá absorbance 1,0 přibližně 50 μg/mL dvouřetězcové DNA nebo 40 μg/mL RNA. Poměr obou měření (A260/A280) poskytuje přibližnou míru čistoty vzorku.

Farmaceutický průmysl. Výrobci léčiv používají měření absorbance ke zjištění, jak rychle tableta uvolňuje účinnou látku, a ke sledování rozkladu léčiva během skladování.

Medicína. Mnoho automatizovaných přístrojů pro krevní testy měří absorbanci barevných chemických reakcí a stanovuje tak hladiny glukózy, jaterních enzymů a bilirubinu.

Potraviny a nápoje. Barva piva se měří absorbancí při 430 nm metodou Evropské úmluvy o pivovarnictví (EBC). Podobné metody se používají ke kontrole barvy vína a nealkoholických nápojů.

Omezení Beerova-Lambertova zákona

Zákon předpokládá, že světlo má jedinou přesně určenou vlnovou délku a že vzorek světlo nerozptyluje. V několika běžných situacích přestává platit:

• Vysoká koncentrace. Přibližně nad 0,01 mol/L začnou spolu rozpuštěné molekuly interagovat a absorbance přestane s koncentrací růst lineárně.
• Zakalené vzorky nebo vzorky obsahující částice. Suspenze a zakalené kapaliny světlo nejen absorbují, ale také rozptylují, což zvyšuje naměřenou absorbanci. Beerův-Lambertův zákon rozptyl nezohledňuje; pro neprůhledné nebo rozptylující vzorky, například prášky, se používá související model nazývaný Kubelka-Munkova teorie.
• Chemické změny během měření. Některé látky se působením světla rozkládají nebo se během měření mění v závislosti na pH, což průběžně mění naměřenou hodnotu.
• Změny teploty. Molární absorpční koeficient závisí na teplotě, takže měření provedená při nestejných teplotách nelze přímo porovnávat.

Historie

Zákon se vyvíjel více než jedno století díky práci tří vědců. Pierre Bouguer v 1729 popsal, že každá stejně silná vrstva materiálu absorbuje stejný podíl světla, které jí prochází. Johann Heinrich Lambert tento vztah matematicky přeformuloval ve své knize Photometria z roku 1760 a ukázal, že absorbance roste přímo úměrně délce optické dráhy. August Beer v 1852 zákon rozšířil a ukázal, že absorbance roste přímo úměrně také koncentraci. Kombinovaný zákon se někdy na počest všech tří vědců nazývá Bouguerův-Beerův-Lambertův zákon.

Často kladené otázky

K čemu se Beerův-Lambertův zákon používá? Vypočítává, kolik světla roztok absorbuje, a opačným postupem umožňuje zjistit neznámou koncentraci z naměřené absorbance. Je proto základem UV-Vis spektrofotometrie, běžné laboratorní metody měření množství látky v roztoku.

Jaké jednotky Beerův-Lambertův zákon používá? Délka optické dráhy se udává v centimetrech, molární absorpční koeficient v L/(mol·cm) a koncentrace v mol/L. Samotná absorbance nemá žádné jednotky, i když se někdy označuje jako „AU“, tedy jednotky absorbance. Dosazení jiných jednotek do vzorce bez předchozího převodu vede k nesprávnému výsledku.

Proč moje naměřená absorbance není úměrná koncentraci? Nejčastějšími příčinami jsou koncentrace vyšší než přibližně 0,01 mol/L, zakalený vzorek nebo vzorek obsahující částice, případně měření výrazně mimo rozsah 0,3–0,9, v němž jsou přístroje nejpřesnější. Zředění vzorku a opakované měření obvykle ukáže, která příčina se uplatňuje.

Jaký je rozdíl mezi absorbancí a transmitancí? Transmitance je podíl světla, který projde vzorkem. Absorbance je záporný logaritmus o základu 10 transmitance: A = −log₁₀(T). S rostoucí absorbancí transmitance klesá.

Jaký je rozdíl mezi absorbancí a optickou hustotou? Jde o stejnou veličinu. Termín „optická hustota“ se častěji používá v biologii, zatímco „absorbance“ je běžnější v chemii.

Jaký rozsah absorbance je nejpřesnější? Přibližně 0,3 až 0,9. Pod touto hranicí převažuje nad signálem šum přístroje. Nad přibližně 1,5 způsobuje chybu rozptýlené světlo uvnitř přístroje a nad přibližně 2,5 většina přístrojů již nedokáže poskytnout spolehlivý výsledek.

Reference

1. Beer, A. (1852). „Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten.“ Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. Swinehart, D. F. (1962). „The Beer-Lambert Law.“ Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S. a Popp, J. (2020). „The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure.“ ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.