Kalkulačka koncentrace DNA | Převodník A260 na ng/μL

Kalkulačka koncentrace DNA

Kalkulačka koncentrace DNA převádí měření UV absorbance při 260 nanometrech, označované jako A260, na koncentraci DNA v nanogramech na mikrolitr (ng/µl). Uvádí také celkové množství DNA ve vzorku v mikrogramech (µg).

Co je absorbance A260?

A260 je množství ultrafialového světla, které roztok absorbuje při vlnové délce 260 nanometrů. DNA absorbuje UV záření nejsilněji právě v blízkosti této vlnové délky kvůli svým nukleotidovým bázím. Spektrofotometr měří A260 po změření slepého vzorku, při němž se použije stejný pufr jako u vzorku, čímž se odstraní absorpce pozadí. Čím více DNA roztok obsahuje, tím vyšší je naměřená hodnota A260.

Vzorec pro výpočet koncentrace DNA

Dvouvláknová DNA pohlcuje UV záření úměrně své koncentraci, což popisuje Lambertův–Beerův zákon. Při standardní dráze světla 1 centimetr obsahuje roztok s hodnotou A260 1,0 asi 50 ng/µL dvouvláknové DNA. Toto číslo, převodní činitel 50 pro DNA, převádí libovolnou hodnotu A260 na koncentraci:

Koncentrace DNA (ng/µL) = A260 × 50 × faktor ředění

Faktor ředění zohledňuje jakékoli naředění provedené před měřením vzorku. Vzorek měřený bez ředění má faktor ředění 1.

Jak vypočítat celkový výtěžek DNA

Po zjištění koncentrace lze celkovou hmotnost DNA ve vzorku vypočítat z jeho objemu:

Celkové množství DNA (µg) = koncentrace (ng/µl) × objem (µl) ÷ 1000

Jak vypočítat koncentraci DNA: postup krok za krokem

1. Před měřením vzorek důkladně promíchejte. DNA může ulpívat na stěnách zkumavky nebo se nerovnoměrně usazovat.
2. Pokud je vzorek vysoce koncentrovaný, zřeďte jej tak, aby hodnota A260 ležela mezi 0,1 a 1,0. Mimo tento rozsah jsou údaje spektrofotometru nejméně spolehlivé.
3. Proveďte vynulování spektrofotometru pomocí stejného pufru, který byl použit k ředění, a poté změřte vzorek při 260 nm.
4. Do kalkulačky zadejte hodnotu A260, objem vzorku a faktor ředění, a získáte koncentraci i celkový výtěžek.

Příklady výpočtu

Příklad 1: neředěný vzorek

Hodnota A260 je 0,5, vzorek nebyl ředěn (faktor ředění 1) a jeho objem je 100 µL.

• Koncentrace = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Celkové množství DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Příklad 2: naředěný vzorek

Vzorek 50 µL byl před měřením zředěn 10krát a hodnota A260 vyšla 0,75.

• Koncentrace = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Celkové množství DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Výpočet faktoru ředění

Faktor ředění = celkový objem po naředění ÷ objem původního vzorku.

Přidáním 5 µL roztoku DNA k 45 µL pufru vznikne celkový objem 50 µL, takže faktor ředění je 50 ÷ 5 = 10. Vzorek, který nebyl naředěn, má faktor ředění 1.

Obvyklé rozsahy koncentrace DNA

Koncentrace závisí na typu vzorku a způsobu extrakce. Výsledek hluboko mimo očekávaný rozsah pro danou metodu může ukazovat na problém s extrakcí nebo se samotným měřením.

Omezení měření UV absorbance

Měření A260 je rychlé, ale nejde o nejcitlivější ani nejselektivnější metodu pro DNA. Proteiny, RNA a některé složky pufru také absorbují světlo v blízkosti 260 nm a mohou naměřenou hodnotu zvýšit. Vědci často společně s koncentrací kontrolují poměr A260/A280, aby odhalili kontaminaci proteiny; poměr kolem 1,8 obvykle ukazuje na čistý vzorek DNA. Metody založené na fluorescenčních barvivech, například testy Qubit, se vážou pouze na dvouřetězcovou DNA a poskytují přesnější měření u zředěných nebo nečistých vzorků, vyžadují však další reagencie a fluorometr.

Často kladené otázky

Jak vypočítat koncentraci DNA z hodnoty A260?

Vynásobte naměřenou hodnotu A260 hodnotou 50, což je standardní konverzní faktor pro dvouřetězcovou DNA, a poté výsledek vynásobte faktorem ředění. Pokud vzorek nebyl naředěn, použijte faktor ředění 1.

Jaký je správný poměr A260/A280?

Poměr kolem 1,8 obvykle ukazuje na čistý vzorek DNA. Nižší poměr naznačuje kontaminaci proteiny. Poměr vyšší než 2,0 může znamenat kontaminaci RNA.

Lze tuto kalkulačku použít pro RNA?

Ne přímo, protože RNA používá konverzní faktor 40 ng/µl namísto 50. Chcete-li odhadnout koncentraci RNA, vynásobte výsledek kalkulačky hodnotou 0,8 (40 ÷ 50), nebo přímo použijte A260 × 40 × faktor ředění.

Proč by se hodnota A260 měla pohybovat mezi 0,1 a 1,0?

Absorbance zůstává přibližně úměrná koncentraci, jak popisuje Beerův-Lambertův zákon, především v tomto rozsahu. Mimo něj jsou měření méně spolehlivá, takže vzorek, který je příliš koncentrovaný nebo příliš zředěný, je třeba před opětovným měřením naředit nebo zkoncentrovat.

Jaký je rozdíl mezi koncentrací a čistotou?

Koncentrace vyjadřuje, kolik DNA je přítomno, v ng/µl. Čistota vyjadřuje, nakolik je vzorek čistý; posuzuje se především podle poměrů absorbance, jako je A260/A280. Vzorek může mít vysokou koncentraci a přesto být nečistý, nebo může mít nízkou koncentraci a být velmi čistý.

Jak převést ng/µl na µg/ml?

Tyto dvě jednotky jsou číselně stejné. 1 ng/µl se rovná 1 µg/ml, protože jednotka hmotnosti i jednotka objemu se mění v poměru 1000.

Reference

1. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. Journal of Visualized Experiments. Úplný text v PubMed Central — koncentrační konstanty 50 pro DNA a 40 pro RNA; poměr A260/A280 přibližně 1,8 pro čistou DNA; nižší poměry naznačují bílkoviny nebo jiné nečistoty.
2. Massachusettský technologický institut (MIT), OpenCourseWare. 7.13 Experimental Microbial Genetics: UV spectrophotometric measurement of DNA concentration and purity. Protokol spektrofotometrie MIT OCW — pro přesné měření musí hodnota A260 ležet mezi 0,1 a 1.