Kalkulátor účinnosti qPCR: Nástroj pro analýzu standardní křivky

Kalkulátor účinnosti qPCR

Kalkulátor účinnosti qPCR odhaduje, jak dobře reakce kvantitativní PCR (qPCR) kopíruje cílovou sekvenci DNA při každém amplifikačním cyklu. Pomocí hodnot Ct (číslo cyklu, při kterém fluorescenční signál překročí stanovený práh) z řady ředění vypočítá účinnost, směrnici, průsečík a R².

Co je účinnost qPCR?

Kvantitativní PCR sleduje fluorescenci při kopírování cílové sekvence DNA v reakci, cyklus po cyklu. Účinnost amplifikace popisuje, jak se množství cílové DNA zvětšuje s každým cyklem. Při účinnosti 100 % se množství cílové DNA v každém cyklu zdvojnásobí.

Skutečné reakce zřídka dosahují přesně 100 %. Většina laboratoří považuje účinnost mezi 90 % a 110 % za přijatelnou pro spolehlivou kvantifikaci. Hodnota pod 90 % nebo nad 110 % poukazuje na problém, například nevhodný návrh primerů, inhibitory PCR přenesené z izolace vzorku nebo chyby při pipetování v řadě ředění.

Účinnost je nejdůležitější při porovnávání genové exprese mezi vzorky. Běžná metoda ΔΔCt pro výpočet násobné změny předpokládá, že každá reakce probíhá s účinností 100 %. Pokud se naměřená účinnost liší od 100 % nebo pokud mají cílový gen a referenční gen rozdílné účinnosti, mohou být výsledky násobné změny nepřesné.

Vzorec pro účinnost qPCR

Účinnost se vypočítá ze směrnice kalibrační křivky, tedy přímky vzniklé vynesením hodnot Ct proti logaritmu o základu 10 (log10) množství výchozí DNA v řadě ředění.

E = 10^(-1/směrnice) - 1

E je účinnost vyjádřená jako desetinné číslo (pro vyjádření v procentech se násobí 100). Směrnice je směrnice přímky kalibrační křivky. Je záporná, protože Ct roste s poklesem množství výchozí DNA.

Směrnice -3,32 odpovídá účinnosti 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301 - 1 ≈ 1,00

To vychází proto, že 10násobné ředění by mělo posunout Ct přibližně o 3,32 cyklu, pokud reakce v každém cyklu zdvojnásobí množství DNA, protože log2(10) je přibližně 3,32.

V praxi se za přijatelnou považuje směrnice mezi -3,1 a -3,6. Tento rozsah odpovídá účinnosti přibližně 90 % až 110 %. Směrnice bližší hodnotě -3,1 dává vyšší vypočtenou účinnost; směrnice bližší hodnotě -3,6 dává nižší účinnost.

Jak vypočítat účinnost qPCR: metoda kalibrační křivky

1. Připravte řadu ředění. Začněte nejkoncentrovanějším vzorkem a každý následující vzorek řeďte stejným faktorem, obvykle 10násobně. Proveďte qPCR každého ředění a zaznamenejte jeho hodnotu Ct.
2. Převeďte každé ředění na hodnotu log10. Pokud je první, nejkoncentrovanější vzorek označen jako pozice 0, má vzorek číslo i hodnotu log10 (relativního množství) rovnou -i × log10 (ředicí faktor).
3. Pro každé ředění vyneste Ct (svislá osa) proti hodnotě log10 (vodorovná osa) a proveďte lineární regresi.
4. Odečtěte směrnici, průsečík a R² regresní přímky.
5. Dosaďte směrnici do vzorce E = 10^(-1/směrnice) - 1 a získáte účinnost.

Kritéria kvality kalibrační křivky

• R² alespoň 0,98. Tato hodnota měří, jak těsně body odpovídají přímce. Nižší hodnota často poukazuje na chyby při pipetování nebo nekonzistentní amplifikaci.
• Směrnice mezi -3,1 a -3,6. Tento rozsah odpovídá účinnosti 90-110%.
• Nejméně tři body ředění. Pět nebo šest bodů poskytuje spolehlivější přímku a usnadňuje odhalení odlehlé hodnoty.
• Nejkoncentrovanější vzorek by měl mít Ct přibližně 15-20. Nejvíce zředěný vzorek by měl zůstat pod Ct 35, protože vyšší hodnoty se blíží mezi detekce.

Praktický příklad

Řada pěti 10násobných ředění poskytuje tyto hodnoty Ct, od nejkoncentrovanějšího po nejméně koncentrovaný vzorek: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Hodnoty log10 (relativního množství) jsou 0, -1, -2, -3, -4, protože každý krok ředění přidává -log10(10), tedy -1. Ct se při každém kroku zvýší o 3,5 cyklu, takže body leží na přímce a lineární regrese dává:

• Směrnice: -3,5
• Průsečík: 15,0
• R²: 1,0

Účinnost: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286 - 1 ≈ 0,931, tedy přibližně 93 %.

Účinnost 93 % s R² = 1,0 splňuje standardní kritéria kvality a je vhodná pro kvantifikaci genové exprese.

Příklad kódu

Tato funkce v JavaScriptu používá stejnou metodu jako kalkulátor. Index každé hodnoty Ct se před výpočtem logaritmu neguje, protože první, nejkoncentrovanější vzorek má nejvyšší relativní množství a každý následující vzorek je více zředěný.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Proč je účinnost důležitá pro genovou expresi

Výpočty násobné změny, včetně metody ΔΔCt, předpokládají, že každá reakce v každém cyklu zdvojnásobí množství své cílové sekvence. Pokud mají cílový gen a referenční gen odlišnou naměřenou účinnost, prostý vzorec ΔΔCt vnáší chybu. Vědci často přecházejí na výpočet korigovaný o účinnost, například na metodu, kterou popsal Michael Pfaffl v roce 2001, pokud se účinnosti liší o více než přibližně pět procentních bodů. Pokyny MIQE, široce citovaný soubor standardů pro uvádění údajů o qPCR zveřejněný v roce 2009, doporučují, aby studie vedle výsledků kvantifikace uváděly vypočtenou účinnost, směrnici a R².

Často kladené otázky

Jaké procento účinnosti qPCR je dobré?

Za přijatelnou se obecně považuje hodnota mezi 90 % a 110 %, přičemž dobře optimalizované testy dosahují zhruba 95-105%. Směrnice -3,32 odpovídá přesně 100 %.

Proč je moje účinnost qPCR vyšší než 110 %?

Mezi běžné příčiny patří chyby při pipetování v řadě ředění, dimery primerů, inhibitory, které nerovnoměrně ovlivňují koncentrované a zředěné vzorky, nebo fluorescenční práh nastavený mimo exponenciální fázi amplifikace. Křivka tání s více než jedním píkem může poukazovat na dimery primerů.

Proč je moje účinnost qPCR nižší než 90 %?

Pravděpodobnými příčinami jsou nevhodný návrh primerů, inhibitory PCR přenesené z izolace vzorku nebo neoptimální teplota nasedání primerů. Kontrola specificity primerů a provedení teplotního gradientu mohou pomoci odhalit příčinu.

Co znamená nízká hodnota R²?

R² měří, jak dobře hodnoty Ct odpovídají přímce vůči logaritmu ředění. Hodnota nižší než 0,98 naznačuje nepřesné pipetování, inhibovaný vzorek nebo bod ředění blízko meze detekce.

Kolik bodů ředění potřebuje kalibrační křivka?

Nejméně tři, což je minimum potřebné pro lineární regresi. Pět nebo šest bodů poskytuje spolehlivější směrnici a usnadňuje odhalení odlehlých hodnot.

Může se účinnost mezi experimenty měnit?

Ano. Účinnost může ovlivnit nová šarže reagencií, nová šarže primerů, jiný typ vzorku nebo jiný přístroj qPCR. Mnoho laboratoří účinnost znovu kontroluje každých několik měsíců nebo při použití každé nové šarže reagencií.

Reference

1. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification, 2015. Svec a kol. 2015 (PMC) — E = 10^(−1/směrnice) − 1 a směrnice přibližně −3,3 pro řadu s 10násobným ředěním při účinnosti 100 %.
2. Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 2001. Pfaffl 2001 (PMC) — model relativní kvantifikace korigovaný o účinnost; Pfafflovo E = 10^(−1/směrnice) je faktor amplifikace na cyklus, rovný 1 plus účinnost použitá v tomto článku.