Vypočítejte účinnost PCR z hodnot Ct a faktorů ředění. Analyzujte standardní křivky, určete účinnost amplifikace a ověřte své kvantitativní PCR experimenty.
Hodnota musí být kladná
Hodnota musí být kladná
Hodnota musí být kladná
Hodnota musí být kladná
Hodnota musí být kladná
Zadejte platná data pro vygenerování grafu
Účinnost qPCR je měřítkem toho, jak dobře PCR reakce funguje. Účinnost 100 % znamená, že množství PCR produktu se zdvojnásobí s každým cyklem během exponenciální fáze.
Účinnost se vypočítává ze sklonu standardní křivky, která se získává vykreslením Ct hodnot proti logaritmu počáteční koncentrace šablony (řada ředění).
Účinnost (E) se vypočítává pomocí vzorce:
E = 10^(-1/slope) - 1
Účinnost kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR) je kritickým parametrem, který přímo ovlivňuje přesnost a spolehlivost vašich experimentů qPCR. Kalkulátor účinnosti qPCR pomáhá výzkumníkům určit, jak efektivně jejich PCR reakce amplifikují cílové DNA sekvence s každým cyklem tepelného zpracování. Ideální reakce qPCR by měly mít účinnost mezi 90-110 %, což naznačuje, že množství PCR produktu se přibližně zdvojnásobí s každým cyklem během exponenciální fáze.
Špatná amplifikační účinnost může vést k nepřesné kvantifikaci, nespolehlivým výsledkům a chybným experimentálním závěrům. Vypočítáním a sledováním účinnosti qPCR můžete optimalizovat podmínky reakce, validovat návrhy primerů a zajistit kvalitu vašich kvantitativních PCR dat.
Tento kalkulátor používá metodu standardní křivky, která vykresluje hodnoty cyklu (Ct) proti logaritmu koncentrace šablony (reprezentované sériovými zředěními), aby určila účinnost vašeho qPCR testu. Výsledný sklon této standardní křivky je poté použit k výpočtu amplifikační účinnosti pomocí jednoduchého matematického vzorce.
Účinnost reakce qPCR se vypočítá ze sklonu standardní křivky pomocí následujícího vzorce:
Kde:
Pro ideální PCR reakci s 100% účinností (dokonalé zdvojení ampliconů s každým cyklem) by sklon byl -3.32. To je proto, že:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (nebo 100%)}
Účinnost v procentech se vypočítá vynásobením desetinné účinnosti číslem 100:
\text{Účinnost (%)} = E \times 100\%
Standardní křivka se vytváří vykreslením Ct hodnot (osa y) proti logaritmu počáteční koncentrace šablony nebo faktoru zředění (osa x). Vztah mezi těmito proměnnými by měl být lineární a kvalita tohoto lineárního vztahu se hodnotí pomocí koeficientu determinace (R²).
Pro spolehlivé výpočty účinnosti qPCR:
Příprava dat: Kalkulátor přijímá vaše Ct hodnoty pro každé zředění a faktor zředění jako vstupy.
Logaritmická transformace: Řada zředění je transformována do logaritmického měřítka (logaritmus na základě 10).
Lineární regrese: Kalkulátor provádí analýzu lineární regrese na log-transformovaných datech, aby určil sklon, y-úsek a hodnotu R².
Výpočet účinnosti: Pomocí hodnoty sklonu se účinnost vypočítá pomocí vzorce E = 10^(-1/slope) - 1.
Interpretace výsledků: Kalkulátor zobrazí účinnost jako procento, spolu se sklonem a hodnotou R², aby vám pomohl posoudit spolehlivost vašeho qPCR testu.
Postupujte podle těchto kroků pro výpočet účinnosti qPCR:
Nastavte počet zředění: Vyberte, kolik zředění máte ve své standardní křivce (doporučuje se mezi 3-7 body).
Zadejte faktor zředění: Zadejte faktor zředění použitý mezi po sobě jdoucími vzorky (např. 10 pro 10-násobné zředění, 5 pro 5-násobné zředění).
Zadejte Ct hodnoty: Zadejte Ct hodnoty pro každé zředění. Typicky první zředění (Zředění 1) obsahuje nejvyšší koncentraci šablony, což vede k nejnižší hodnotě Ct.
Zobrazte výsledky: Kalkulátor automaticky vypočítá a zobrazí:
Interpretujte výsledky: Zhodnoťte, zda vaše účinnost qPCR spadá do přijatelného rozsahu (90-110 %) a zda hodnota R² naznačuje spolehlivou standardní křivku (≥ 0.98).
Kopírujte výsledky: Použijte tlačítko "Kopírovat výsledky" pro zkopírování všech vypočítaných hodnot pro vaše záznamy nebo publikace.
Pojďme projít příkladem:
Když jsou vykresleny na standardní křivce:
Kalkulátor provede lineární regresi a určí:
Pomocí vzorce účinnosti:
To naznačuje dobrou účinnost qPCR 93 %, což spadá do přijatelného rozsahu 90-110 %.
Před použitím nového páru primerů pro kvantitativní experimenty je nezbytné ověřit jejich výkon. Výpočty účinnosti qPCR pomáhají:
Při vývoji nových qPCR testů jsou výpočty účinnosti klíčové pro:
V experimentech s relativní kvantifikací je znalost účinnosti PCR nezbytná pro:
V klinických a diagnostických prostředích je účinnost qPCR důležitá pro:
Pro aplikace v oblasti životního prostředí a bezpečnosti potravin pomáhají výpočty účinnosti:
I když je metoda standardní křivky nejběžnějším přístupem k výpočtu účinnosti qPCR, existují alternativní metody:
Tato metoda vypočítává účinnost z fluorescenčních dat jednoho amplifikačního křivky, aniž by vyžadovala sérii zředění. Software jako LinRegPCR analyzuje exponenciální fázi jednotlivých reakcí, aby určil účinnost.
Výhody:
Nevýhody:
Digitální PCR (dPCR) poskytuje absolutní kvantifikaci bez nutnosti standardní křivky nebo výpočtů účinnosti.
Výhody:
Nevýhody:
Některé softwary pro analýzu qPCR nabízejí metody srovnávací kvantifikace, které odhadují účinnost bez úplné standardní křivky.
Výhody:
Nevýhody:
Vývoj qPCR a výpočtů účinnosti se v posledních několika desetiletích významně vyvinul:
Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla vynalezena Karym Mullisem v roce 1983, což revolucionalizovalo molekulární biologii. Nicméně tradiční PCR byla pouze kvalitativní nebo polo-kvantitativní. První systém pro PCR v reálném čase byl vyvinut na začátku 90. let Russell Higuchim a jeho kolegy, kteří prokázali, že sledování produktů PCR, jak se hromadí (použitím fluorescenčního ethidia bromidu), může poskytnout kvantitativní informace.
Jak se technologie qPCR vyvíjela, výzkumníci si uvědomili důležitost standardizace a validace. Koncept účinnosti PCR se stal centrálním pro spolehlivou kvantifikaci:
Obor pokračoval ve vývoji s:
Dnes je považováno za nezbytné vypočítat a uvádět účinnost qPCR pro publikaci spolehlivých dat qPCR a nástroje jako je tento kalkulátor pomáhají výzkumníkům dodržovat osvědčené postupy v oboru.
1' Excel vzorec pro výpočet účinnosti qPCR ze sklonu
2' Umístěte do buňky B2, pokud je sklon v buňce A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel vzorec pro převod účinnosti na procenta
6' Umístěte do buňky C2, pokud je účinnost desetinná v buňce B2
7=B2*100
8
9' Funkce pro výpočet účinnosti ze Ct hodnot a faktoru zředění
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Vypočítat lineární regresi
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Vypočítat sklon
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Vypočítat účinnost
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R funkce pro výpočet účinnosti qPCR ze Ct hodnot a faktoru zředění
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Vytvořit log zředění
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Provést lineární regresi
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Extrakce sklonu a R-squared
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Vypočítat účinnost
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Vrátit výsledky
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Příklad použití
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Účinnost: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Sklon: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-squared: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Vypočítat účinnost qPCR ze Ct hodnot a faktoru zředění.
8
9 Parametry:
10 ct_values (list): Seznam Ct hodnot
11 dilution_factor (float): Faktor zředění mezi po sobě jdoucími vzorky
12
13 Návratová hodnota:
14 dict: Slovník obsahující účinnost, sklon, r_squared a intercept
15 """
16 # Vytvořit log zředění
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Provést lineární regresi
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Vypočítat účinnost
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Vykreslit standardní křivku s regresní linií.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Vygenerovat body pro regresní linii
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log zředění')
48 plt.ylabel('Ct hodnota')
49 plt.title('Standardní křivka qPCR')
50
51 # Přidat rovnici a R² do grafu
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Účinnost = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Příklad použití
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Účinnost: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Sklon: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-squared: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Vykreslit standardní křivku
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Vypočítat účinnost qPCR ze Ct hodnot a faktoru zředění
3 * @param {Array<number>} ctValues - Pole Ct hodnot
4 * @param {number} dilutionFactor - Faktor zředění mezi po sobě jdoucími vzorky
5 * @returns {Object} Objekt obsahující účinnost, sklon, rSquared a intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Vytvořit log zředění
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Vypočítat průměry pro lineární regresi
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Vypočítat sklon a intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Vypočítat R-squared
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Vypočítat účinnost
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Příklad použití
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Účinnost: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Sklon: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-squared: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Dobrá účinnost qPCR obvykle spadá mezi 90 % a 110 % (0.9-1.1). Účinnost 100 % představuje dokonalé zdvojení PCR produktu s každým cyklem. Účinnosti mimo tento rozsah mohou naznačovat problémy s návrhem primerů, podmínkami reakce nebo přítomností inhibitorů.
Účinnosti vyšší než 100 % mohou nastat z důvodu:
Nízká hodnota R² (pod 0.98) naznačuje špatnou linearitu ve vaší standardní křivce, což může být způsobeno:
Pro spolehlivé výpočty účinnosti je zapotřebí minimálně 3 zředění, ale doporučuje se 5-6 bodů pro přesnější výsledky. Tyto body by měly pokrýt celý dynamický rozsah očekávaných koncentrací šablony ve vašich experimentálních vzorcích.
V relativní kvantifikaci pomocí metody ΔΔCt se předpokládá, že účinnosti mezi cílovými a referenčními geny jsou stejné (ideálně 100 %). Když se účinnosti výrazně liší:
Ne, účinnost by měla být určena pro každý pár primerů a měla by být znovu validována:
Inhibitory PCR mohou:
Termíny se často používají zaměnitelně, ale:
Pro zlepšení účinnosti qPCR:
Porovnávání vzorků s výrazně různými účinnostmi se nedoporučuje, protože:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. Pokyny MIQE: minimální informace pro publikaci experimentů s kvantitativní PCR v reálném čase. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. Nový matematický model pro relativní kvantifikaci v reálném čase RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Jak dobrý je odhad účinnosti PCR: Doporučení pro přesné a robustní hodnocení účinnosti qPCR. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Ultimátní experiment qPCR: Produkování kvalitních, reprodukovatelných dat poprvé. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Účinnost amplifikace: propojení základní linie a zkreslení v analýze dat kvantitativní PCR. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetická analýza PCR: sledování amplifikačních reakcí DNA v reálném čase. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Příručka aplikací pro PCR v reálném čase. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Příručka pro PCR v reálném čase. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Náš kalkulátor účinnosti qPCR poskytuje jednoduchý, ale mocný nástroj pro výzkumníky k validaci a optimalizaci jejich experimentů kvantitativní PCR. Přesným výpočtem účinnosti ze standardních křivek můžete zajistit spolehlivou kvantifikaci, řešit problematické testy a dodržovat osvědčené postupy v experimentaci qPCR.
Vyzkoušejte náš kalkulátor ještě dnes, abyste zlepšili kvalitu a spolehlivost svých dat qPCR!
Objevte další nástroje, které by mohly být užitečné pro vaši pracovní postup.