Kalkulačka ligace DNA - Výpočet poměrů inzertu a vektoru pro molekulární klonování

Ligace DNA je krok molekulárního klonování, při kterém se fragment vložky spojí s plazmidovým vektorem enzymem T4 DNA ligázou. Kalkulátor ligace DNA vypočítá, kolik mikrolitrů DNA vložky a DNA vektoru smíchat, aby reakce dosáhla zvoleného molárního poměru vložky k vektoru.

Co kalkulátor dělá

Kalkulátor přijímá šest vstupních údajů: koncentraci vektoru, délku vektoru, koncentraci vložky, délku vložky, cílový molární poměr vložky k vektoru a celkový objem reakce. Umožňuje také nastavit množství použité DNA vektoru, které je ve výchozím nastavení 50 nanogramů (ng). Z těchto hodnot vypočítá objem vektoru k napipetování, objem vložky k napipetování a množství pufru nebo vody, které je třeba přidat do celkového objemu reakce.

Koncentrace se udává v nanogramech na mikrolitr (ng/μL) a obvykle se odečítá z přístroje Nanodrop nebo Qubit. Délka se udává v párech bází (bp). Jeden kilopár bází (kb) se rovná 1000 párů bází. Molární poměr udává, kolik molekul vložky má připadat na jednu molekulu vektoru. Nejde o hmotnostní poměr.

Proč se používá molární poměr, a ne hmotnost

Stejné hmotnosti DNA neobsahují stejný počet molekul. Krátká vložka váží méně než dlouhý vektor při stejném počtu molekul. Smíchání stejných množství krátké vložky a dlouhého vektoru v nanogramech by vedlo k příliš malému počtu molekul vložky ve srovnání s počtem molekul vektoru. Kalkulátor upravuje hmotnost vložky podle poměru délek fragmentů, takže výsledná směs obsahuje zamýšlený počet molekul vložky na jednu molekulu vektoru.

Vzorec pro ligaci DNA

Potřebné množství DNA vložky v nanogramech je:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

kde $m_i$ je množství vložky v nanogramech, $m_v$ množství vektoru v nanogramech, $k_i$ délka vložky v kilopárech bází, $k_v$ délka vektoru v kilopárech bází a R cílový molární poměr vložky k vektoru.

Jakmile je toto množství známo, kalkulátor převede každé množství na objem, který lze napipetovat:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

kde $V_v$ a $V_i$ jsou objemy vektoru a vložky v mikrolitrech, $c_v$ a $c_i$ jsou koncentrace vektoru a vložky v nanogramech na mikrolitr, $V_b$ je objem pufru a $V_t$ celkový objem reakce.

Pokud je součet objemů vektoru a vložky větší než celkový objem reakce, nezbývá místo pro pufr, ligázu ani vodu. V takovém případě kalkulátor oznámí, že celkový objem je příliš malý, místo aby zobrazil záporné množství pufru.

Příklad výpočtu

Výzkumník klonuje genový fragment o délce 1 kb do plazmidového vektoru o délce 3 kb. Plánuje použít 50 ng DNA vektoru při molárním poměru vložky k vektoru 3:1 v reakci o objemu 20 μL.

Vstupní údaje:

• Koncentrace vektoru: 50 ng/μL
• Délka vektoru: 3000 bp (3 kb)
• Koncentrace vložky: 25 ng/μL
• Délka vložky: 1000 bp (1 kb)
• Molární poměr: 3
• Celkový objem: 20 μL
• Množství vektoru: 50 ng

Krok 1: množství vložky

ng vložky = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Krok 2: objemy

Objem vektoru = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Objem vložky = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Objem pufru = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reakce se skládá z 1 μL vektoru, 2 μL vložky a 17 μL pufru nebo vody, do kterých se také přidává ligáza a její reakční pufr. Tato směs poskytuje tři molekuly vložky na jednu molekulu vektoru.

Typické molární poměry pro ligaci

Při standardním klonování s lepkavými přečnívajícími konci se nejčastěji používá poměr vložky k vektoru 3:1. Ligace, při nichž se spojují tupé konce, jsou méně účinné, proto je běžný vyšší poměr, například 5:1. U velmi velkých vložek někdy lépe funguje nižší poměr blížící se 1:1, protože velké fragmenty již obsahují mnoho párů bází na jednu molekulu.

Často kladené otázky

Co je ligace DNA?

Ligace DNA je spojení dvou fragmentů DNA, obvykle plazmidového vektoru a vložky, do jedné souvislé molekuly. Enzym T4 DNA ligáza utěsňuje spojení mezi konci fragmentů.

Co znamená molární poměr vložky k vektoru?

Jde o počet molekul DNA vložky připadajících na jednu molekulu vektoru v reakci. Poměr 3:1 znamená tři molekuly vložky na každou molekulu vektoru bez ohledu na poměr jejich hmotností.

Proč nepoužít stejná množství vektoru a vložky v nanogramech?

Fragmenty DNA různých délek mají různou hmotnost na molekulu. Vložka o délce 1 kb váží na jednu molekulu přibližně třetinu toho, co vektor o délce 3 kb. Stejná množství každého z nich v nanogramech by neposkytla stejný počet molekul, proto kalkulátor upravuje hmotnost vložky tak, aby odpovídala cílovému molárnímu poměru.

Co znamená, že je celkový objem příliš malý?

Znamená to, že samotné objemy vektoru a vložky již spotřebují celý objem reakce, takže nezbývá místo pro pufr ani ligázu. Řešením je zvýšit celkový objem reakce nebo použít koncentrovanější zásobní roztoky DNA.

Lze tento kalkulátor použít pro klonování metodami Gibson Assembly nebo Golden Gate?

Ne. Tyto metody používají odlišnou chemii reakce a obvykle cílí na ekvimolární množství všech fragmentů, nikoli na pevný poměr vložky k vektoru. Výpočty objemů se u nich liší od standardního klonování s T4 ligázou.

Jaké množství DNA vektoru se obvykle používá?

50 ng je běžné výchozí množství pro standardní ligační reakci. Laboratoře používají také množství od 25 do 100 ng, upravená podle koncentrace DNA a měřítka reakce.