Kalkulátor ligace DNA

Úvod

Ligace DNA je kritická technika molekulární biologie používaná k spojení fragmentů DNA dohromady pomocí kovalentních vazeb. Kalkulátor ligace DNA je nezbytný nástroj pro výzkumníky, který pomáhá určit optimální množství vektorové a vložené DNA potřebné pro úspěšné reakce ligace. Vypočítáním správných molárních poměrů mezi vektorem (plasmidem) a vloženými fragmenty DNA tento kalkulátor zajišťuje efektivní experimenty molekulární klonování a minimalizuje plýtvání činidly a selhání reakcí.

Reakce ligace jsou základní pro genetické inženýrství, syntetickou biologii a postupy molekulárního klonování. Umožňují vědcům vytvářet rekombinantní DNA molekuly vložením genů zájmu do plasmidových vektorů pro následnou transformaci do hostitelských organismů. Úspěch těchto reakcí silně závisí na použití vhodného množství DNA komponent, což je přesně to, co tento kalkulátor pomáhá určit.

Ať už konstruujete expresní vektory, vytváříte genové knihovny nebo provádíte rutinní subklonování, tento kalkulátor ligace DNA vám pomůže optimalizovat vaše experimentální podmínky a zvýšit vaši úspěšnost. Zadáním několika klíčových parametrů o vašich vzorcích DNA můžete rychle získat přesné objemy potřebné pro vaši specifickou reakci ligace.

Vzorec/Vypočet

Kalkulátor ligace DNA používá základní vzorec molekulární biologie, který zohledňuje různé velikosti a koncentrace fragmentů DNA, které se spojují. Hlavní výpočet určuje, kolik vložené DNA je potřeba vzhledem k vektorové DNA na základě jejich příslušných délek a požadovaného molárního poměru.

Výpočet množství vložené DNA

Množství potřebné vložené DNA (v nanogramech) se vypočítá pomocí následujícího vzorce:

$\text{ng vložené DNA} = \text{ng vektoru} \times \frac{\text{kb velikost vložené DNA}}{\text{kb velikost vektoru}} \times \text{molární poměr}$

Kde:

• ng vektoru = množství vektorové DNA použité v reakci (typicky 50-100 ng)
• kb velikost vložené DNA = délka vloženého fragmentu DNA v kilobázích (kb)
• kb velikost vektoru = délka vektorové DNA v kilobázích (kb)
• molární poměr = požadovaný poměr molekul vložené DNA k molekulám vektoru (typicky 3:1 až 5:1)

Výpočty objemu

Jakmile je určeno požadované množství vložené DNA, jsou vypočítány potřebné objemy pro reakci:

$\text{Objem vektoru (μL)} = \frac{\text{ng vektoru}}{\text{koncentrace vektoru (ng/μL)}}$

$\text{Objem vložené DNA (μL)} = \frac{\text{ng vložené DNA}}{\text{koncentrace vložené DNA (ng/μL)}}$

$\text{Objem pufru/vody (μL)} = \text{Celkový objem reakce (μL)} - \text{Objem vektoru (μL)} - \text{Objem vložené DNA (μL)}$

Příklad výpočtu

Pojďme projít praktickým příkladem:

• Koncentrace vektoru: 50 ng/μL
• Délka vektoru: 3000 bp (3 kb)
• Koncentrace vložené DNA: 25 ng/μL
• Délka vložené DNA: 1000 bp (1 kb)
• Požadovaný molární poměr (vložená:vektor): 3:1
• Celkový objem reakce: 20 μL
• Množství vektoru k použití: 50 ng

Krok 1: Vypočítejte požadované množství vložené DNA $\text{ng vložené DNA} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Krok 2: Vypočítejte objemy $\text{Objem vektoru} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Objem vložené DNA} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Objem pufru/vody} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Tento výpočet zajišťuje, že v reakci jsou tři molekuly vložené DNA na každou molekulu vektoru, což optimalizuje šance na úspěšnou ligaci.

Krok za krokem průvodce používáním kalkulátoru

Náš kalkulátor ligace DNA je navržen tak, aby byl intuitivní a jednoduchý. Postupujte podle těchto kroků pro výpočet optimálních objemů pro vaši reakci ligace:

1. Zadejte informace o vektoru:

   • Zadejte koncentraci vašeho vektoru v ng/μL
   • Zadejte délku vektoru v bazích (bp)
   • Uveďte množství vektorové DNA, které chcete použít v reakci (ng)

2. Zadejte informace o vložené DNA:

   • Zadejte koncentraci vaší vložené DNA v ng/μL
   • Zadejte délku vložené DNA v bazích (bp)

3. Nastavte parametry reakce:

   • Uveďte požadovaný molární poměr (vložená:vektor) - typicky mezi 3:1 a 5:1
   • Zadejte celkový objem reakce v μL (obvykle 10-20 μL)

4. Zobrazte výsledky:

   • Kalkulátor automaticky zobrazí:
     • Požadovaný objem vektoru (μL)
     • Požadovaný objem vložené DNA (μL)
     • Objem pufru/vody, který je třeba přidat (μL)
     • Celkový objem reakce (μL)
     • Množství vektoru a vložené DNA v reakci (ng)

5. Kopírovat výsledky (volitelné):

   • Použijte tlačítko "Kopírovat výsledky", abyste zkopírovali všechny výpočty do schránky pro váš laboratorní zápisník nebo protokoly

Kalkulátor provádí validační kontroly, aby zajistil, že všechny vstupy jsou kladná čísla a že celkový objem je dostatečný pro požadované objemy DNA. Pokud jsou zjištěny nějaké chyby, užitečné chybové zprávy vás nasměrují k opravě vstupů.

Případy použití

Kalkulátor ligace DNA je cenný v mnoha aplikacích molekulární biologie:

Molekulární klonování

Nejčastějším případem použití je standardní molekulární klonování, kde vědci vkládají geny nebo fragmenty DNA do plasmidových vektorů. Kalkulátor zajišťuje optimální podmínky pro:

• Subklonování genů mezi různými expresními vektory
• Vytváření fúzních proteinů spojením několika fragmentů genů
• Konstrukci reporterových genových testů
• Budování plasmidových knihoven

Syntetická biologie

V syntetické biologii, kde se často sestavuje více fragmentů DNA:

• Reakce Gibson Assembly těží z přesných poměrů vložené:vektorové DNA
• Systémy Golden Gate assembly vyžadují specifické koncentrace DNA
• BioBrick assembly standardizovaných genetických částí
• Konstrukce syntetických genetických obvodů

Vývoj diagnostických souprav

Při vývoji molekulárních diagnostických nástrojů:

• Klonování genetických markerů specifických pro onemocnění
• Konstrukce pozitivních kontrolních plasmidů
• Vývoj kalibračních standardů pro qPCR

Systémy pro expresi proteinů

Pro výzkumníky pracující na produkci proteinů:

• Optimalizace poměrů vložené:vektorové DNA pro vysoce kopírové expresní vektory
• Konstrukce indukovatelných expresních systémů
• Vytváření sekrečních vektorů pro purifikaci proteinů

Aplikace CRISPR-Cas9

V aplikacích genome editing:

• Klonování vodicích RNA do CRISPR vektorů
• Vytváření dárcovských šablon pro homology-directed repair
• Budování knihoven vodicích RNA pro screening

Obtížné ligace

Kalkulátor je obzvláště cenný pro obtížné scénáře ligace:

• Klonování velkých vložených fragmentů (>5 kb)
• Vkládání velmi malých fragmentů (<100 bp)
• Blunt-end ligace, které mají nižší účinnost
• Reakce pro více fragmentů assembly

Alternativy

Zatímco náš kalkulátor ligace DNA poskytuje přesné výpočty pro tradiční reakce ligace, existuje několik alternativních přístupů pro spojování fragmentů DNA:

1. Gibson Assembly: Používá exonukleázu, polymerázu a ligázu v jedné reakci v jedné zkumavce pro spojení překrývajících se fragmentů DNA. Není potřeba tradiční výpočet ligace, ale poměry koncentrací jsou stále důležité.

2. Golden Gate Assembly: Používá enzymy typu IIS pro směrovou, bezjizvou assembly více fragmentů. Vyžaduje ekvimolární množství všech fragmentů.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Používá exonukleázu k vytvoření jednovláknových overhangů, které se navzájem spojují. Typicky používá ekvimolární poměry fragmentů.

4. In-Fusion Cloning: Komerční systém, který umožňuje spojení fragmentů s 15 bp překryvy. Používá specifický poměr na základě velikosti fragmentů.

5. Gateway Cloning: Používá specifickou rekombinaci namísto ligace. Vyžaduje specifické vstupní a cílové vektory.

6. Empirické testování: Některé laboratoře dávají přednost nastavení více reakcí ligace s různými poměry vložené:vektorové DNA (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) a určují, který funguje nejlépe pro jejich specifické konstrukty.

7. Softwarové kalkulátory: Komerční softwarové balíčky jako Vector NTI a SnapGene zahrnují kalkulátory ligace s dalšími funkcemi, jako je analýza restrikčních míst.

Historie

Vývoj výpočtů ligace DNA paralelně sleduje evoluci technik molekulárního klonování, které revolucionalizovaly molekulární biologii a biotechnologie.

Raný vývoj (1970. léta)

Koncept ligace DNA pro molekulární klonování se objevil v raných 70. letech s průkopnickou prací Paula Berga, Herberta Boyera a Stanleyho Cohena, kteří vyvinuli první rekombinantní DNA molekuly. Během tohoto období byly reakce ligace do značné míry empirické, přičemž výzkumníci používali pokusy a omyly k určení optimálních podmínek.

Objev restrikčních enzymů a DNA ligázy poskytl nezbytné nástroje pro řezání a znovu spojování molekul DNA. T4 DNA ligáza, izolovaná z E. coli infikovaných bakteriofágem T4, se stala standardním enzymem pro spojování fragmentů DNA díky své schopnosti ligovat jak tupé, tak kohezivní konce.

Období zdokonalování (1980-1990)

Jak se molekulární klonování stalo běžnějším, výzkumníci začali vyvíjet systematičtější přístupy k reakcím ligace. Význam molárních poměrů mezi vektorovou a vloženou DNA se stal zřejmým, což vedlo k vývoji základního vzorce, který se používá dodnes.

Během tohoto období výzkumníci zjistili, že nadbytek vložené DNA (typicky 3:1 až 5:1 molární poměr vložené DNA k vektoru) obecně zvyšuje účinnost ligace pro standardní aplikace klonování. Tyto znalosti byly původně sdíleny prostřednictvím laboratorních protokolů a postupně se dostaly do manuálů a učebnic molekulární biologie.

Moderní éra (2000-současnost)

Vznik výpočetních nástrojů a online kalkulátorů v 2000. letech učinil přesné výpočty ligace dostupnější pro výzkumníky. Jak se techniky molekulární biologie stávaly sofistikovanějšími, potřeba přesných výpočtů se stala kritičtější, zejména pro obtížné klonovací projekty zahrnující více fragmentů nebo velké vložené fragmenty.

Dnes jsou výpočty ligace DNA nedílnou součástí pracovních toků molekulárního klonování, přičemž specializované kalkulátory, jako je tento, pomáhají výzkumníkům optimalizovat jejich experimenty. Základní vzorec zůstal většinou nezměněn, i když naše porozumění faktorům ovlivňujícím účinnost ligace se zlepšilo.

Vznik alternativních metod klonování, jako je Gibson Assembly a Golden Gate klonování, zavedl nové potřeby výpočtů, ale základní koncept molárních poměrů mezi fragmenty DNA zůstává důležitý napříč těmito technikami.

Příklady kódu

Zde jsou implementace kalkulátoru ligace DNA v různých programovacích jazycích:

1' Excel VBA Funkce pro kalkulátor ligace DNA
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Vypočítejte požadované množství vložené DNA v ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Vypočítejte objem vektoru v μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Vypočítejte objem vložené DNA v μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Vypočítejte objem pufru/vody v μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Příklad použití v buňce:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Vypočítejte objemy pro reakci ligace DNA.
5    
6    Parametry:
7    vector_concentration (float): Koncentrace vektorové DNA v ng/μL
8    vector_length (float): Délka vektorové DNA v bazích
9    insert_concentration (float): Koncentrace vložené DNA v ng/μL
10    insert_length (float): Délka vložené DNA v bazích
11    molar_ratio (float): Požadovaný molární poměr vložené:vektorové
12    total_volume (float): Celkový objem reakce v μL
13    vector_amount (float): Množství vektorové DNA k použití v ng (výchozí: 50)
14    
15    Návrat:
16    dict: Slovník obsahující vypočítané objemy a množství
17    """
18    # Vypočítejte objem vektoru
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Vypočítejte požadované množství vložené DNA
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Vypočítejte objem vložené DNA
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Vypočítejte objem pufru/vody
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Příklad použití
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Vložení: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Pufr: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Celkem: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Převést délky na kb pro výpočet
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Vypočítejte požadované množství vložené DNA
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Vypočítejte objemy
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Příklad použití
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Vložení: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Pufr: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Celkem: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Převést délky na kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Vypočítejte požadované množství vložené DNA
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Vypočítejte objemy
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Zaokrouhlit na 2 desetinná místa
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Vložení: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Pufr: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Celkem: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Převést délky na kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Vypočítejte požadované množství vložené DNA
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Vypočítejte objemy
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Zaokrouhlit na 2 desetinná místa
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Vložení: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Pufr: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Celkem: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Často kladené otázky (FAQ)

Jaký je optimální molární poměr pro ligaci DNA?

Optimální molární poměr vložené DNA k vektorové DNA obvykle činí od 3:1 do 5:1 pro standardní aplikace ligace. Nicméně, to se může lišit v závislosti na specifickém scénáři ligace:

• Pro ligace s kohezivními konci: 1:1 až 3:1
• Pro ligace s tupými konci: 3:1 až 5:1
• Pro velké vložené fragmenty (>10 kb): 1:1 až 2:1
• Pro malé vložené fragmenty (<500 bp): 5:1 až 10:1
• Pro assembly více fragmentů: 3:1 pro každý vložený fragment vůči vektoru

Proč moje reakce ligace selhává, i když používám vypočítané objemy?

Existuje několik faktorů, které mohou ovlivnit účinnost ligace nad rámec molárního poměru:

1. Kvalita DNA: Ujistěte se, že jak vektor, tak vložená DNA mají čisté konce bez poškození
2. Defoforizace: Zkontrolujte, zda byl váš vektor dephosphorylován, což brání auto-ligaci
3. Aktivita enzymu: Ověřte, že vaše ligáza je aktivní a použita při správné teplotě
4. Doba inkubace: Některé ligace profitují z delší inkubace (přes noc při 16 °C)
5. Podmínky pufru: Ujistěte se, že je použit správný pufr s ATP
6. Kontaminanty: Purifikujte DNA, abyste odstranili inhibitory, jako je EDTA nebo vysoká sůl

Kolik vektorové DNA bych měl použít v reakci ligace?

Obvykle se doporučuje použít 50-100 ng vektorové DNA pro standardní reakce ligace. Použití příliš velkého množství vektoru může vést k vyššímu pozadí neřezaného nebo auto-ligovaného vektoru, zatímco příliš malé množství může snížit účinnost transformace. Pro obtížné ligace možná budete muset optimalizovat toto množství.

Měl bych upravit výpočty pro ligace s tupými konci versus kohezivními konci?

Ano. Ligace s tupými konci jsou obecně méně účinné než ligace s kohezivními konci. Pro ligace s tupými konci použijte:

• Vyšší molární poměry (3:1 až 5:1 nebo i vyšší)
• Více T4 DNA ligázy (typicky 2-3krát více)
• Delší časy inkubace
• Zvažte přidání PEG pro zvýšení účinnosti ligace

Jak vypočítám ligaci pro více vložených fragmentů?

Pro assembly více fragmentů:

1. Vypočítejte každé požadované množství vložené DNA jednotlivě pomocí stejného vzorce
2. Udržujte stejný celkový molární poměr (např. pro dva vložené fragmenty použijte 1.5:1.5:1 vložená1:vložení2:vektor)
3. Upravte celkový objem reakce tak, aby zahrnoval všechny fragmenty DNA
4. Zvažte sekvenční ligaci nebo použití metod assembly jako Gibson Assembly pro více fragmentů

Mohu použít tento kalkulátor pro Gibson Assembly nebo Golden Gate Assembly?

Tento kalkulátor je speciálně navržen pro tradiční reakce ligace pomocí restrikčních enzymů a ligázy. Pro Gibson Assembly se obvykle doporučují ekvimolární množství všech fragmentů (1:1 poměr), ačkoliv základní výpočet množství DNA na základě délky je podobný. Pro Golden Gate Assembly se také obvykle používají ekvimolární poměry všech komponent.

Jak zohledním dephosphorylaci vektoru ve svých výpočtech?

Dephosphorylace vektoru (odstranění 5' fosfátových skupin) brání auto-ligaci, ale nemění výpočty množství. Nicméně, pro dephosphorylované vektory:

1. Použijte čerstvou vloženou DNA s nepoškozenými 5' fosfáty
2. Zvažte použití mírně vyšších poměrů vložené:vektorové DNA (4:1 až 6:1)
3. Ujistěte se o delších časech ligace (alespoň 1 hodina při pokojové teplotě nebo přes noc při 16 °C)

Jaký je minimální celkový objem reakce, který bych měl použít?

Minimální praktický objem reakce je obvykle 10 μL, což umožňuje adekvátní míchání a zabraňuje problémům s odpařováním. Pokud vaše vypočítané objemy DNA překročí požadovaný objem reakce, máte několik možností:

1. Použijte koncentrovanější vzorky DNA
2. Zmenšete množství použitého vektoru (např. 25 ng místo 50 ng)
3. Zvyšte celkový objem reakce
4. Zvažte koncentraci vašich vzorků DNA

Jak dlouho bych měl inkubovat svou reakci ligace?

Optimální doby inkubace se liší v závislosti na typu ligace:

• Ligace s kohezivními konci: 1 hodina při pokojové teplotě (22-25 °C) nebo 4-16 hodin při 16 °C
• Ligace s tupými konci: 2-4 hodiny při pokojové teplotě nebo přes noc (12-16 hodin) při 16 °C
• Rychlé ligace (použití vysoce koncentrované ligázy): 5-15 minut při pokojové teplotě

Mohu znovu použít zbylou reakci ligace pro transformaci?

Ano, směsi ligace lze obvykle skladovat při -20 °C a znovu použít pro transformaci. Nicméně, každé zmrazení a rozmrazení může snížit účinnost. Pro nejlepší výsledky:

1. Rozdělte směs ligace před zmrazením
2. Teple inaktivujte ligázu (65 °C po dobu 10 minut) před skladováním
3. Použijte do 1-2 měsíců pro optimální výsledky

Odkazy

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. vydání). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. vydání). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molekulární biologie Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - Protokol ligace DNA. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Technická reference molekulárního klonování. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Technický manuál pro klonování. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/