Υπολογιστής Απόδοσης qPCR: Εργαλείο Ανάλυσης Πρότυπης Καμπύλης

Υπολογιστής απόδοσης qPCR

Ένας υπολογιστής απόδοσης qPCR εκτιμά πόσο καλά μια αντίδραση ποσοτικής PCR (qPCR) αντιγράφει την αλληλουχία DNA-στόχο σε κάθε κύκλο ενίσχυσης. Χρησιμοποιεί τιμές Ct (τον αριθμό κύκλου στον οποίο το σήμα φθορισμού υπερβαίνει ένα καθορισμένο κατώφλι) από μια σειρά αραιώσεων, για να υπολογίσει την απόδοση, την κλίση, την τεταγμένη επί την αρχή και το R².

Τι είναι η απόδοση qPCR;

Η ποσοτική PCR παρακολουθεί τον φθορισμό καθώς μια αντίδραση αντιγράφει μια αλληλουχία DNA-στόχο, κύκλο προς κύκλο. Η απόδοση της ενίσχυσης περιγράφει πόσο αυξάνεται η ποσότητα του DNA-στόχου σε κάθε κύκλο. Σε απόδοση 100%, η ποσότητα του DNA-στόχου διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο.

Οι πραγματικές αντιδράσεις σπάνια φτάνουν ακριβώς το 100%. Τα περισσότερα εργαστήρια θεωρούν αποδεκτή για αξιόπιστη ποσοτικοποίηση μια απόδοση μεταξύ 90% και 110%. Μια τιμή κάτω από 90% ή πάνω από 110% υποδεικνύει πρόβλημα, όπως κακό σχεδιασμό εκκινητών, αναστολείς PCR που μεταφέρθηκαν από την εκχύλιση του δείγματος ή σφάλματα στην πιπέτωση κατά τη σειρά αραιώσεων.

Η απόδοση έχει τη μεγαλύτερη σημασία κατά τη σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ δειγμάτων. Η συνηθισμένη μέθοδος ΔΔCt για τον υπολογισμό της πολλαπλάσιας μεταβολής υποθέτει ότι κάθε αντίδραση πραγματοποιείται με απόδοση 100%. Όταν η μετρούμενη απόδοση διαφέρει από 100% ή όταν ένα γονίδιο-στόχος και ένα γονίδιο αναφοράς έχουν διαφορετικές αποδόσεις, τα αποτελέσματα της πολλαπλάσιας μεταβολής μπορεί να είναι ανακριβή.

Τύπος απόδοσης qPCR

Η απόδοση υπολογίζεται από την κλίση της πρότυπης καμπύλης, μιας ευθείας που προκύπτει από τη γραφική παράσταση των τιμών Ct έναντι του λογαρίθμου βάσης-10 (log10) της αρχικής ποσότητας DNA σε μια σειρά αραιώσεων.

E = 10^(-1/κλίση) - 1

Η E είναι η απόδοση, εκφρασμένη ως δεκαδικός αριθμός (πολλαπλασιάστε επί 100 για να τη μετατρέψετε σε ποσοστό). Η κλίση είναι η κλίση της ευθείας της πρότυπης καμπύλης. Είναι αρνητική, επειδή το Ct αυξάνεται καθώς μειώνεται η αρχική ποσότητα DNA.

Κλίση -3,32 αντιστοιχεί σε απόδοση 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Αυτό ισχύει επειδή μια αραίωση κατά 10 φορές θα πρέπει να μετατοπίζει το Ct κατά περίπου 3,32 κύκλους, αν η αντίδραση διπλασιάζει το DNA σε κάθε κύκλο, αφού ο log2(10) είναι περίπου 3,32.

Στην πράξη, μια κλίση μεταξύ -3,1 και -3,6 θεωρείται αποδεκτή. Αυτό το εύρος αντιστοιχεί σε απόδοση περίπου 90% έως 110%. Κλίση πιο κοντά στο -3,1 δίνει υψηλότερη υπολογισμένη απόδοση, ενώ κλίση πιο κοντά στο -3,6 δίνει χαμηλότερη.

Πώς υπολογίζεται η απόδοση qPCR: η μέθοδος της πρότυπης καμπύλης

1. Προετοιμάστε μια σειρά αραιώσεων. Ξεκινήστε με το πιο συμπυκνωμένο δείγμα και αραιώστε το με σταθερό συντελεστή, συνήθως 10 φορές, για κάθε επόμενο δείγμα. Εκτελέστε qPCR σε κάθε αραίωση και καταγράψτε την τιμή Ct.
2. Μετατρέψτε κάθε αραίωση σε τιμή log10. Αν το πρώτο, πιο συμπυκνωμένο δείγμα θεωρηθεί ως θέση 0, το δείγμα με αριθμό i έχει log10(σχετικής ποσότητας) ίσο με -i × log10(συντελεστή αραίωσης).
3. Σχεδιάστε το Ct (κατακόρυφος άξονας) έναντι της τιμής log10 (οριζόντιος άξονας) για κάθε αραίωση και εκτελέστε γραμμική παλινδρόμηση.
4. Καταγράψτε την κλίση, την τεταγμένη επί την αρχή και το R² της ευθείας παλινδρόμησης.
5. Αντικαταστήστε την κλίση στον τύπο E = 10^(-1/κλίση) - 1 για να βρείτε την απόδοση.

Κριτήρια ποιότητας της πρότυπης καμπύλης

• R² τουλάχιστον 0,98. Αυτό μετρά πόσο καλά προσαρμόζονται τα σημεία σε μια ευθεία. Μια χαμηλότερη τιμή συχνά υποδεικνύει σφάλματα στην πιπέτωση ή ασυνεπή ενίσχυση.
• Κλίση μεταξύ -3,1 και -3,6. Αυτό το εύρος αντιστοιχεί σε απόδοση 90–110%.
• Τουλάχιστον τρία σημεία αραίωσης. Πέντε ή έξι σημεία δίνουν πιο αξιόπιστη ευθεία και διευκολύνουν τον εντοπισμό μιας ακραίας τιμής.
• Το πιο συμπυκνωμένο δείγμα θα πρέπει να δίνει Ct περίπου 15-20. Το πιο αραιωμένο δείγμα θα πρέπει να παραμένει κάτω από Ct 35, επειδή οι υψηλότερες τιμές πλησιάζουν το όριο ανίχνευσης.

Λυμένο παράδειγμα

Μια σειρά πέντε σημείων με αραίωση 10 φορές δίνει τις ακόλουθες τιμές Ct, από το πιο έως το λιγότερο συμπυκνωμένο δείγμα: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Οι τιμές log10(σχετικής ποσότητας) είναι 0, -1, -2, -3, -4, επειδή κάθε βήμα αραίωσης προσθέτει -log10(10), δηλαδή -1. Το Ct αυξάνεται κατά 3,5 κύκλους σε κάθε βήμα, επομένως τα σημεία βρίσκονται σε ευθεία και η γραμμική παλινδρόμηση δίνει:

• Κλίση: -3,5
• Τεταγμένη επί την αρχή: 15,0
• R²: 1,0

Απόδοση: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, ή περίπου 93%.

Απόδοση 93% με R² = 1,0 πληροί τα τυπικά κριτήρια ποιότητας και είναι κατάλληλη για ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης.

Παράδειγμα κώδικα

Αυτή η συνάρτηση JavaScript ακολουθεί την ίδια μέθοδο με τον υπολογιστή. Ο δείκτης κάθε τιμής Ct αντιστρέφεται πριν από τον υπολογισμό του λογαρίθμου, επειδή το πρώτο, πιο συμπυκνωμένο δείγμα έχει τη μεγαλύτερη σχετική ποσότητα και κάθε επόμενο δείγμα είναι πιο αραιωμένο.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Γιατί έχει σημασία η απόδοση για τη γονιδιακή έκφραση

Οι υπολογισμοί της πολλαπλάσιας μεταβολής, συμπεριλαμβανομένης της μεθόδου ΔΔCt, υποθέτουν ότι κάθε αντίδραση διπλασιάζει την ποσότητα του στόχου της σε κάθε κύκλο. Όταν ένα γονίδιο-στόχος και ένα γονίδιο αναφοράς έχουν διαφορετικές μετρούμενες αποδόσεις, ο απλός τύπος ΔΔCt εισάγει σφάλμα. Οι ερευνητές συχνά χρησιμοποιούν έναν υπολογισμό διορθωμένο ως προς την απόδοση, όπως τη μέθοδο που περιέγραψε ο Michael Pfaffl το 2001, όταν οι αποδόσεις διαφέρουν κατά περισσότερες από περίπου πέντε ποσοστιαίες μονάδες. Οι κατευθυντήριες οδηγίες MIQE, ένα ευρέως αναφερόμενο σύνολο προτύπων αναφοράς για qPCR που δημοσιεύτηκε το 2009, συνιστούν στις μελέτες να αναφέρουν την υπολογισμένη απόδοση, την κλίση και το R² μαζί με τα αποτελέσματα ποσοτικοποίησης.

Συχνές ερωτήσεις

Ποιο ποσοστό απόδοσης qPCR θεωρείται καλό;

Γενικά γίνεται αποδεκτό το εύρος μεταξύ 90% και 110%, ενώ οι καλά βελτιστοποιημένες δοκιμασίες κυμαίνονται περίπου στο 95–105%. Κλίση -3,32 αντιστοιχεί ακριβώς σε 100%.

Γιατί η απόδοση qPCR μου είναι πάνω από 110%;

Συνήθεις αιτίες είναι σφάλματα στην πιπέτωση κατά τη σειρά αραιώσεων, διμερή εκκινητών, αναστολείς που επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τα συμπυκνωμένα και τα αραιωμένα δείγματα ή ένα κατώφλι φθορισμού που έχει οριστεί εκτός της εκθετικής φάσης της ενίσχυσης. Μια καμπύλη τήξης με περισσότερες από μία κορυφές μπορεί να υποδεικνύει διμερή εκκινητών.

Γιατί η απόδοση qPCR μου είναι κάτω από 90%;

Πιθανές αιτίες είναι ο κακός σχεδιασμός εκκινητών, οι αναστολείς PCR που μεταφέρθηκαν από την εκχύλιση του δείγματος ή μια μη βέλτιστη θερμοκρασία υβριδοποίησης. Ο έλεγχος της ειδικότητας των εκκινητών και η εκτέλεση θερμοκρασιακής διαβάθμισης μπορούν να βοηθήσουν στον εντοπισμό της αιτίας.

Τι σημαίνει χαμηλή τιμή R²;

Το R² μετρά πόσο καλά οι τιμές Ct προσαρμόζονται σε ευθεία ως προς τη λογαριθμική ποσότητα. Τιμή κάτω από 0,98 υποδηλώνει ασυνέπεια στην πιπέτωση, ανασταλμένο δείγμα ή σημείο αραίωσης κοντά στο όριο ανίχνευσης.

Πόσα σημεία αραίωσης χρειάζεται μια πρότυπη καμπύλη;

Τουλάχιστον τρία, ο ελάχιστος αριθμός που απαιτείται για γραμμική παλινδρόμηση. Πέντε ή έξι σημεία δίνουν πιο αξιόπιστη κλίση και διευκολύνουν τον εντοπισμό ακραίων τιμών.

Μπορεί να αλλάξει η απόδοση μεταξύ πειραμάτων;

Ναι. Μια νέα παρτίδα αντιδραστηρίου, μια νέα παρτίδα εκκινητών, διαφορετικός τύπος δείγματος ή διαφορετικό όργανο qPCR μπορεί να μεταβάλει την απόδοση. Πολλά εργαστήρια επανελέγχουν την απόδοση κάθε λίγους μήνες ή με κάθε νέα παρτίδα αντιδραστηρίου.

Παραπομπές

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. Οι κατευθυντήριες οδηγίες MIQE: ελάχιστες πληροφορίες για τη δημοσίευση πειραμάτων ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Ένα νέο μαθηματικό μοντέλο για τη σχετική ποσοτικοποίηση σε RT-PCR πραγματικού χρόνου. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Πόσο καλός είναι ένας υπολογισμός της απόδοσης PCR: συστάσεις για ακριβή και αξιόπιστη αξιολόγηση της απόδοσης qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.