Υπολογιστής Συγκέντρωσης DNA

Ο υπολογιστής συγκέντρωσης DNA μετατρέπει μια μέτρηση απορρόφησης UV στα 260 νανόμετρα, που ονομάζεται A260, σε συγκέντρωση DNA σε νανογραμμάρια ανά μικρολίτρο (ng/µL). Αναφέρει επίσης τη συνολική ποσότητα DNA στο δείγμα, σε μικρογραμμάρια (µg).

Τι είναι η απορρόφηση A260;

Το A260 είναι η ποσότητα υπεριώδους φωτός που απορροφά ένα διάλυμα σε μήκος κύματος 260 νανομέτρων. Το DNA απορροφά το UV φως πιο έντονα κοντά σε αυτό το μήκος κύματος λόγω των βάσεων των νουκλεοτιδίων του. Το φασματοφωτόμετρο μετρά το A260 αφού πραγματοποιηθεί μέτρηση τυφλού δείγματος με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα με εκείνο του δείγματος, ώστε να αφαιρεθεί η απορρόφηση υποβάθρου. Όσο περισσότερο DNA περιέχει το διάλυμα, τόσο υψηλότερη είναι η μέτρηση A260.

Τύπος συγκέντρωσης DNA

Το δίκλωνο DNA απορροφά το UV φως ανάλογα με τη συγκέντρωσή του, σε μια σχέση που είναι γνωστή ως νόμος Beer–Lambert. Σε τυπική οπτική διαδρομή μήκους 1 εκατοστού, ένα διάλυμα με μέτρηση A260 ίση με 1,0 περιέχει περίπου 50 ng/µL δίκλωνου DNA. Αυτός ο αριθμός, ο συντελεστής μετατροπής, μετατρέπει κάθε μέτρηση A260 σε συγκέντρωση:

Συγκέντρωση DNA (ng/µL) = A260 × 50 × συντελεστής αραίωσης

Ο συντελεστής αραίωσης λαμβάνει υπόψη κάθε αραίωση που έγινε πριν από τη μέτρηση του δείγματος. Για δείγμα που μετρήθηκε χωρίς αραίωση, ο συντελεστής αραίωσης είναι 1.

Πώς υπολογίζεται η συνολική απόδοση DNA

Αφού προσδιοριστεί η συγκέντρωση, η συνολική μάζα DNA στο δείγμα μπορεί να υπολογιστεί από τον όγκο του:

Συνολικό DNA (µg) = συγκέντρωση (ng/µL) × όγκος (µL) ÷ 1000

Πώς υπολογίζεται η συγκέντρωση DNA: βήμα προς βήμα

Αναμείξτε καλά το δείγμα πριν από τη μέτρηση. Το DNA μπορεί να προσκολληθεί στα τοιχώματα του σωληναρίου ή να κατακαθίσει ανομοιόμορφα.
Αραιώστε το δείγμα αν είναι πολύ συμπυκνωμένο, επιδιώκοντας μέτρηση A260 μεταξύ 0,1 και 1,0. Οι μετρήσεις του φασματοφωτομέτρου είναι λιγότερο αξιόπιστες εκτός αυτού του εύρους.
Μηδενίστε το φασματοφωτόμετρο με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε για την αραίωση και, στη συνέχεια, μετρήστε το δείγμα στα 260 nm.
Εισαγάγετε στον υπολογιστή τη μέτρηση A260, τον όγκο του δείγματος και τον συντελεστή αραίωσης, για να λάβετε τη συγκέντρωση και τη συνολική απόδοση. Και τα τρία πεδία πρέπει να συμπληρωθούν και ο όγκος πρέπει να είναι μεγαλύτερος από μηδέν, προτού εμφανιστεί αποτέλεσμα.

Λυμένο παράδειγμα

Παράδειγμα 1: μη αραιωμένο δείγμα

Μέτρηση A260 ίση με 0,5, χωρίς αραίωση (συντελεστής αραίωσης 1) και όγκος δείγματος 100 µL.

Συγκέντρωση = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
Συνολικό DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Παράδειγμα 2: αραιωμένο δείγμα

Ένα σωληνάριο περιέχει 50 µL καθαρισμένου DNA. Μικρό μέρος του αραιώθηκε κατά 10 φορές και το αραιωμένο τμήμα έδωσε μέτρηση A260 ίση με 0,75. Ο συντελεστής αραίωσης μετατρέπει αυτή τη μέτρηση ξανά στη συγκέντρωση του αρχικού σωληναρίου, ενώ τα 50 µL είναι ο όγκος που εισάγεται στο βήμα υπολογισμού της συνολικής απόδοσης.

Συγκέντρωση = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
Συνολικό DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Υπολογισμός του συντελεστή αραίωσης

Συντελεστής αραίωσης = συνολικός όγκος μετά την αραίωση ÷ όγκος του αρχικού δείγματος.

Η προσθήκη 5 µL διαλύματος DNA σε 45 µL ρυθμιστικού διαλύματος δίνει συνολικό όγκο 50 µL, επομένως ο συντελεστής αραίωσης είναι 50 ÷ 5 = 10. Για δείγμα που δεν αραιώθηκε, ο συντελεστής αραίωσης είναι 1.

Τυπικά εύρη συγκέντρωσης DNA

Η συγκέντρωση εξαρτάται από τον τύπο του δείγματος και τη μέθοδο εκχύλισης. Οι εκχυλίσεις γονιδιωματικού DNA κυμαίνονται συνήθως περίπου μεταξύ 10 και 100 ng/µL. Τα παρασκευάσματα πλασμιδιακού DNA συχνά δίνουν υψηλότερες συγκεντρώσεις, μερικές φορές αρκετές εκατοντάδες ng/µL. Ένα αποτέλεσμα πολύ έξω από το αναμενόμενο εύρος για μια δεδομένη μέθοδο μπορεί να υποδεικνύει πρόβλημα στην εκχύλιση ή στην ίδια τη μέτρηση.

Περιορισμοί της μέτρησης απορρόφησης UV

Η μέτρηση του A260 είναι γρήγορη, αλλά δεν είναι η πιο ευαίσθητη ή ειδική μέθοδος για DNA. Οι πρωτεΐνες, το RNA και ορισμένα συστατικά των ρυθμιστικών διαλυμάτων απορροφούν επίσης φως κοντά στα 260 nm και μπορεί να αυξήσουν τεχνητά τη μέτρηση. Οι επιστήμονες συχνά ελέγχουν τον λόγο A260/A280 παράλληλα με τη συγκέντρωση, για να ελέγξουν αν υπάρχει επιμόλυνση από πρωτεΐνες· λόγος κοντά στο 1,8 συνήθως υποδεικνύει καθαρό δείγμα DNA. Οι μέθοδοι με φθορίζουσες χρωστικές, όπως οι δοκιμασίες Qubit, δεσμεύονται μόνο στο δίκλωνο DNA και δίνουν ακριβέστερη μέτρηση για αραιά ή μη καθαρά δείγματα, αν και απαιτούν επιπλέον αντιδραστήρια και φθορισμόμετρο.

Συχνές ερωτήσεις

Πώς υπολογίζεται η συγκέντρωση DNA από το A260;

Πολλαπλασιάστε τη μέτρηση A260 επί 50, τον τυπικό συντελεστή μετατροπής για δίκλωνο DNA, και στη συνέχεια πολλαπλασιάστε επί τον συντελεστή αραίωσης. Αν το δείγμα δεν αραιώθηκε, χρησιμοποιήστε συντελεστή αραίωσης 1.

Ποιος είναι ένας καλός λόγος A260/A280;

Λόγος κοντά στο 1,8 συνήθως υποδεικνύει καθαρό δείγμα DNA. Χαμηλότερος λόγος υποδηλώνει επιμόλυνση από πρωτεΐνες. Λόγος μεγαλύτερος από 2,0 μπορεί να υποδεικνύει επιμόλυνση από RNA.

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί αυτός ο υπολογιστής για RNA;

Όχι άμεσα, επειδή για το RNA χρησιμοποιείται συντελεστής μετατροπής 40 ng/µL αντί για 50. Για να εκτιμήσετε τη συγκέντρωση RNA, πολλαπλασιάστε το αποτέλεσμα του υπολογιστή επί 0,8 (40 ÷ 50) ή χρησιμοποιήστε απευθείας τον τύπο A260 × 40 × συντελεστής αραίωσης.

Γιατί πρέπει η μέτρηση A260 να κυμαίνεται μεταξύ 0,1 και 1,0;

Η απορρόφηση παραμένει περίπου ανάλογη της συγκέντρωσης, όπως περιγράφεται από τον νόμο Beer–Lambert, κυρίως μέσα σε αυτό το εύρος. Εκτός αυτού, οι μετρήσεις γίνονται λιγότερο αξιόπιστες, επομένως ένα δείγμα που είναι υπερβολικά συμπυκνωμένο ή υπερβολικά αραιό πρέπει να αραιωθεί ή να συμπυκνωθεί πριν από νέα μέτρηση.

Ποια είναι η διαφορά μεταξύ συγκέντρωσης και καθαρότητας;

Η συγκέντρωση μετρά πόσο DNA υπάρχει, σε ng/µL. Η καθαρότητα μετρά πόσο καθαρό είναι το δείγμα και κρίνεται κυρίως από λόγους απορρόφησης όπως ο A260/A280. Ένα δείγμα μπορεί να έχει υψηλή συγκέντρωση και να παραμένει μη καθαρό ή να έχει χαμηλή συγκέντρωση και να είναι πολύ καθαρό.

Πώς μετατρέπονται τα ng/µL σε µg/mL;

Οι δύο μονάδες είναι αριθμητικά ισοδύναμες. 1 ng/µL ισούται με 1 µg/mL, επειδή τόσο η μονάδα μάζας όσο και η μονάδα όγκου μεταβάλλονται κατά συντελεστή 1000.

Παραπομπές

Sambrook, J. και Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3η έκδ.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R. και Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.

Υπολογιστής Συγκέντρωσης DNA | Μετατροπέας A260 σε ng/μL