Calculadora de Concentración de ADN

Una calculadora de concentración de ADN convierte una lectura de absorbancia UV a 260 nanómetros, denominada A260, en la concentración de ADN en nanogramos por microlitro (ng/µL). También informa de la cantidad total de ADN en una muestra, en microgramos (µg).

¿Qué es la absorbancia A260?

A260 es la cantidad de luz ultravioleta que absorbe una solución a una longitud de onda de 260 nanómetros. El ADN absorbe la luz UV con mayor intensidad cerca de esta longitud de onda debido a sus bases nucleotídicas. Un espectrofotómetro mide A260 después de realizar una lectura del blanco, que utiliza el mismo tampón que la muestra para eliminar la absorbancia de fondo. Cuanto más ADN haya en la solución, mayor será la lectura de A260.

Fórmula de la concentración de ADN

El ADN bicatenario absorbe la luz UV en proporción a su concentración, una relación conocida como ley de Beer-Lambert. En una trayectoria óptica estándar de 1 centímetro, una solución con una lectura de A260 de 1,0 contiene aproximadamente 50 ng/µL de ADN bicatenario. Este número, el factor de conversión, transforma cualquier lectura de A260 en una concentración:

Concentración de ADN (ng/µL) = A260 × 50 × factor de dilución

El factor de dilución tiene en cuenta cualquier dilución realizada antes de medir la muestra. Una muestra medida sin diluir tiene un factor de dilución de 1.

Cómo calcular el rendimiento total de ADN

Una vez conocida la concentración, la masa total de ADN de la muestra puede obtenerse a partir de su volumen:

ADN total (µg) = concentración (ng/µL) × volumen (µL) ÷ 1000

Cómo calcular la concentración de ADN: paso a paso

Mezcle bien la muestra antes de medirla. El ADN puede adherirse a las paredes del tubo o sedimentarse de manera desigual.
Diluya la muestra si está muy concentrada, con el objetivo de obtener una lectura de A260 entre 0,1 y 1,0. Las lecturas del espectrofotómetro son menos fiables fuera de ese intervalo.
Ajuste el blanco del espectrofotómetro con el mismo tampón utilizado para la dilución y, a continuación, mida la muestra a 260 nm.
Introduzca la lectura de A260, el volumen de la muestra y el factor de dilución en la calculadora para obtener la concentración y el rendimiento total. Deben rellenarse las tres casillas y el volumen debe ser mayor que cero para que aparezca un resultado.

Ejemplo resuelto

Ejemplo 1: muestra sin diluir

Una lectura de A260 de 0,5, sin dilución (factor de dilución 1), y un volumen de muestra de 100 µL.

Concentración = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
ADN total = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Ejemplo 2: muestra diluida

Un tubo contiene 50 µL de ADN purificado. Una pequeña porción se diluyó 10 veces y la porción diluida dio una lectura de A260 de 0,75. El factor de dilución convierte esa lectura de nuevo a la concentración del tubo original, y los 50 µL son el volumen introducido para calcular el rendimiento total.

Concentración = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
ADN total = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Cálculo del factor de dilución

Factor de dilución = volumen total después de la dilución ÷ volumen de la muestra original.

Añadir 5 µL de solución de ADN a 45 µL de tampón da un volumen total de 50 µL, por lo que el factor de dilución es 50 ÷ 5 = 10. Una muestra que no se ha diluido tiene un factor de dilución de 1.

Intervalos habituales de concentración de ADN

La concentración depende del tipo de muestra y del método de extracción. Las extracciones de ADN genómico suelen situarse entre aproximadamente 10 y 100 ng/µL. Las preparaciones de ADN plasmídico suelen producir concentraciones mayores, a veces de varios cientos de ng/µL. Un resultado muy alejado del intervalo esperado para un método determinado puede indicar un problema con la extracción o con la propia medición.

Limitaciones de la medición de la absorbancia UV

Medir A260 es rápido, pero no es el método más sensible ni específico para el ADN. Las proteínas, el ARN y algunos componentes del tampón también absorben luz cerca de 260 nm y pueden aumentar la lectura. A menudo, los científicos comprueban la relación A260/A280 junto con la concentración para detectar contaminación por proteínas; una relación cercana a 1,8 suele indicar una muestra de ADN puro. Los métodos basados en colorantes fluorescentes, como los ensayos Qubit, se unen únicamente al ADN bicatenario y proporcionan una lectura más precisa para muestras diluidas o impuras, aunque requieren reactivos adicionales y un fluorómetro.

Preguntas frecuentes

¿Cómo se calcula la concentración de ADN a partir de A260?

Multiplique la lectura de A260 por 50, el factor de conversión estándar para el ADN bicatenario, y después multiplique por el factor de dilución. Si la muestra no se diluyó, utilice un factor de dilución de 1.

¿Cuál es una buena relación A260/A280?

Una relación cercana a 1,8 suele indicar una muestra de ADN puro. Una relación menor sugiere contaminación por proteínas. Una relación superior a 2,0 puede indicar contaminación por ARN.

¿Puede utilizarse esta calculadora para el ARN?

No directamente, porque para el ARN se utiliza un factor de conversión de 40 ng/µL en lugar de 50. Para estimar la concentración de ARN, multiplique el resultado de la calculadora por 0,8 (40 ÷ 50), o utilice directamente A260 × 40 × factor de dilución.

¿Por qué la lectura de A260 debe estar entre 0,1 y 1,0?

La absorbancia se mantiene aproximadamente proporcional a la concentración, como describe la ley de Beer-Lambert, principalmente dentro de este intervalo. Fuera de él, las lecturas son menos fiables, por lo que una muestra demasiado concentrada o demasiado diluida debe diluirse o concentrarse antes de volver a medirla.

¿Cuál es la diferencia entre concentración y pureza?

La concentración mide cuánto ADN hay, en ng/µL. La pureza mide el grado de limpieza de la muestra, determinado principalmente a partir de relaciones de absorbancia como A260/A280. Una muestra puede tener una concentración alta y aun así ser impura, o una concentración baja y ser muy pura.

¿Cómo convierto ng/µL a µg/mL?

Las dos unidades son numéricamente iguales. 1 ng/µL equivale a 1 µg/mL, porque tanto la unidad de masa como la unidad de volumen cambian en un factor de 1000.

Referencias

Sambrook, J., y Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.ª ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R., y Desjardins, P. R. (2006). Cuantificación de ADN y ARN mediante espectroscopía de absorción y fluorescencia. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). Valor de las relaciones A260/A280 para medir la pureza de los ácidos nucleicos. BioTechniques, 19(2), 208–210.

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