Calculadora de Concentración de Proteínas | A280 a mg/mL

Calculadora de concentración de proteínas

Una calculadora de concentración de proteínas convierte una lectura de absorbancia de luz de un espectrofotómetro en la cantidad de proteína disuelta en una solución. El resultado suele expresarse en miligramos por mililitro (mg/mL) o microgramos por mililitro (μg/mL). El cálculo se basa en la ley de Beer-Lambert, una relación de la química que vincula la cantidad de luz que absorbe una muestra con la cantidad de una sustancia que contiene.

Cómo se mide la concentración de proteínas

La mayoría de las proteínas absorben con intensidad la luz ultravioleta a una longitud de onda de 280 nanómetros (nm). Esta absorción procede principalmente de dos aminoácidos, el triptófano y la tirosina, presentes en la estructura de la proteína. Un espectrofotómetro hace pasar luz a través de la muestra y mide cuánta luz absorbe la muestra. Esta lectura se denomina absorbancia, o A280 cuando se toma a 280 nm.

Medir la absorbancia a 280 nm es rápido y no destruye la muestra. Esto la diferencia de métodos químicos como los ensayos de Bradford o BCA, descritos más adelante. El método funciona mejor con una proteína purificada en solución y una lectura de absorbancia de entre aproximadamente 0,1 y 1,0. Las lecturas fuera de ese intervalo son menos fiables, por lo que a menudo es necesario diluir la muestra antes de medirla.

Fórmula para calcular la concentración de proteínas

La calculadora reorganiza la ley de Beer-Lambert para despejar la concentración:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — concentración de proteínas, en mg/mL
• A — absorbancia a 280 nm (un número simple, sin unidad)
• DF — factor de dilución, el número de veces que se diluyó la muestra original antes de medirla
• ε — coeficiente de extinción, una constante específica de la proteína, en L/(g·cm)
• l — longitud del recorrido óptico, la distancia que recorre la luz a través de la muestra, en cm (normalmente 1 cm en una cubeta estándar, un recipiente pequeño de vidrio o plástico utilizado en el espectrofotómetro)

Para convertir el resultado a microgramos por mililitro, se multiplica el valor en mg/mL por 1.000. Para obtener la masa total de proteína de la muestra, se multiplica la concentración por el volumen de la muestra en mililitros.

Ejemplo de cálculo

Una muestra presenta una lectura de absorbancia de 0,5 a 280 nm. No se diluyó, por lo que el factor de dilución es 1, y se midió en una cubeta estándar de 1 cm. La proteína es albúmina sérica bovina (BSA), que tiene un coeficiente de extinción de 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

En una muestra de 1 mL, esto equivale aproximadamente a 0,75 mg de proteína total, o 750 μg/mL.

Coeficientes de extinción de proteínas comunes

Cada proteína absorbe la luz de forma diferente, porque tiene un número distinto de residuos de triptófano y tirosina. El coeficiente de extinción describe este comportamiento para una proteína específica a 280 nm, en unidades de L/(g·cm). Entre los valores utilizados habitualmente se incluyen:

La calculadora también puede aceptar un coeficiente de extinción personalizado para una proteína que no aparezca en esta lista. Para una proteína cuya secuencia de aminoácidos se conoce, este valor puede estimarse mediante una fórmula publicada por Gill y von Hippel en 1989: ε₂₈₀ = (residuos de triptófano × 5,500) + (residuos de tirosina × 1,490) + (residuos de cistina × 125). Esta fórmula proporciona un resultado en M⁻¹cm⁻¹, una unidad molar que difiere de los valores basados en masa, expresados en L/(g·cm), indicados arriba. Herramientas gratuitas como ProtParam, alojada en el servidor ExPASy, calculan este valor directamente a partir de una secuencia de proteína.

Longitud del recorrido óptico y factor de dilución

La longitud del recorrido óptico es el ancho de la cubeta que contiene la muestra, medido en centímetros. Las cubetas estándar tienen 1 cm de ancho. Los espectrofotómetros de microvolumen, que miden muestras muy pequeñas, pueden utilizar un recorrido mucho más corto, como 0,1 cm.

El factor de dilución tiene en cuenta cualquier dilución realizada antes de la medición. Si una muestra concentrada produjera una absorbancia superior a 1,0, es habitual diluirla primero con tampón. El factor de dilución equivale al volumen total diluido dividido por el volumen de la muestra original. Por ejemplo, mezclar 10 μL de muestra con 990 μL de tampón produce un volumen total de 1.000 μL y un factor de dilución de 100.

Otras formas de medir la concentración de proteínas

La absorbancia a 280 nm es uno de los varios métodos habituales utilizados en un laboratorio.

• Ensayo de Bradford: utiliza un colorante que cambia de color cuando se une a una proteína. Funciona bien con muestras no purificadas, pero el cambio de color puede variar entre distintas proteínas.
• Ensayo de BCA: se basa en un cambio de color causado por los enlaces peptídicos de la proteína. Es compatible con muchos detergentes, pero tarda más en realizarse que una lectura directa de absorbancia.
• Método de Lowry: es un método más antiguo y muy sensible, pero reacciona mal con algunos componentes habituales de los tampones.

Cada uno de estos tres métodos destruye la muestra. Una medición directa de A280 no lo hace, por lo que la misma muestra puede recuperarse y utilizarse de nuevo.

Preguntas frecuentes

¿Cuál es el intervalo ideal de absorbancia para este método?

Entre 0,1 y 1,0. Por debajo de 0,1, la lectura es imprecisa. Por encima de 1,0, la relación entre la absorbancia y la concentración puede dejar de ser lineal, por lo que la muestra debe diluirse primero.

¿Por qué se mide a 280 nm en lugar de a 260 nm?

Los ácidos nucleicos, como el ADN y el ARN, absorben con intensidad a 260 nm. Las proteínas absorben más a 280 nm debido a su contenido de triptófano y tirosina. Medir a 280 nm reduce la interferencia de los ácidos nucleicos presentes en la muestra.

¿Cómo se obtiene el coeficiente de extinción de una proteína que no aparece en la lista?

Para una proteína cuya secuencia se conoce, una herramienta como ProtParam lo calcula a partir del número de residuos de triptófano, tirosina y cistina. También puede medirse directamente comparando la absorbancia de la muestra con la de una solución de concentración conocida.

¿Funciona este método con una mezcla de proteínas?

Funciona mejor con una sola proteína purificada cuyo coeficiente de extinción se conoce. Una mezcla de proteínas desconocidas, como un lisado celular, suele medirse con el ensayo de Bradford o BCA, ya que estos métodos proporcionan una estimación más uniforme de la proteína total.

¿Pueden los detergentes interferir con la lectura?

Sí. Muchos detergentes absorben luz cerca de 280 nm, lo que puede distorsionar el resultado. Utilizar una muestra en blanco que contenga la misma concentración de detergente ayuda a compensar esa absorbancia de fondo. Las concentraciones muy altas de detergente pueden requerir un ensayo compatible con detergentes, como el BCA.