Calculadora de Concentración de Proteínas | A280 a mg/mL

Calculadora de concentración de proteínas

Una calculadora de concentración de proteínas convierte una lectura de absorbancia de luz de un espectrofotómetro en la cantidad de proteína disuelta en una solución. El resultado suele expresarse en miligramos por mililitro (mg/mL) o en microgramos por mililitro (μg/mL). El cálculo se basa en la ley de Beer-Lambert, una relación de la química que vincula cuánta luz absorbe una muestra con cuánta cantidad de una sustancia contiene.

Cómo se mide la concentración de proteínas

La mayoría de las proteínas absorben con fuerza la luz ultravioleta con una longitud de onda de 280 nanómetros (nm). Esta absorción procede sobre todo de dos aminoácidos, el triptófano y la tirosina, presentes en la estructura de la proteína. Un espectrofotómetro hace pasar luz por la muestra y mide cuánta absorbe. Esta lectura se llama absorbancia, o A280 cuando se toma a 280 nm.

Medir la absorbancia a 280 nm es rápido y no destruye la muestra. Eso la distingue de métodos químicos como el ensayo de Bradford o el de BCA, descritos más abajo. El método funciona mejor con una proteína purificada en solución, con una lectura de absorbancia de entre 0,1 y 1,0 aproximadamente. Las lecturas fuera de ese intervalo son menos fiables, por lo que a menudo hay que diluir la muestra antes de medirla.

Fórmula de la concentración de proteínas

La calculadora reordena la ley de Beer-Lambert para despejar la concentración:

C = (A × FD) / (ε × l)

• C: concentración de proteína, en mg/mL
• A: absorbancia a 280 nm (un número sin unidad)
• FD: factor de dilución, es decir, cuántas veces se diluyó la muestra original antes de medirla
• ε: coeficiente de extinción, una constante propia de cada proteína, en L/(g·cm)
• l: longitud del camino óptico, la distancia que recorre la luz a través de la muestra, en cm (normalmente 1 cm en una cubeta estándar, un pequeño recipiente de vidrio o plástico que se usa en el espectrofotómetro)

Para convertir el resultado a microgramos por mililitro, multiplique el valor en mg/mL por 1.000. Para hallar la masa total de proteína de la muestra, multiplique la concentración por el volumen de la muestra en mililitros.

Ejemplo de cálculo

Una muestra da una lectura de absorbancia de 0,5 a 280 nm. No se diluyó, por lo que el factor de dilución es 1, y se midió en una cubeta estándar de 1 cm. La proteína es la albúmina sérica bovina (BSA), cuyo coeficiente de extinción es de 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

En una muestra de 1 mL, eso equivale a unos 0,75 mg de proteína total, o 750 μg/mL.

Coeficientes de extinción de proteínas comunes

Cada proteína absorbe la luz de manera distinta, porque cada una tiene un número diferente de residuos de triptófano y tirosina. El coeficiente de extinción describe esto para una proteína concreta a 280 nm, en unidades de L/(g·cm). Algunos valores de uso habitual son:

Una calculadora también puede admitir un coeficiente de extinción personalizado para una proteína que no figura en esta lista. Para una proteína de secuencia de aminoácidos conocida, este valor puede estimarse sumando la absorbancia de sus residuos de triptófano, tirosina y cistina, un método publicado por Gill y von Hippel en 1989. ProtParam lo aplica con coeficientes medidos por Pace y sus colaboradores en 1995: ε₂₈₀ = (residuos de triptófano × 5.500) + (residuos de tirosina × 1.490) + (residuos de cistina × 125). Esa fórmula da un resultado en M⁻¹cm⁻¹, una unidad molar, que difiere de los valores basados en la masa en L/(g·cm) indicados más arriba. Herramientas gratuitas como ProtParam, alojada en el servidor ExPASy, calculan este valor directamente a partir de la secuencia de una proteína.

Longitud del camino óptico y factor de dilución

La longitud del camino óptico es el ancho de la cubeta que contiene la muestra, medido en centímetros. Las cubetas estándar tienen 1 cm de ancho. Los espectrofotómetros de microvolumen, que miden muestras muy pequeñas, pueden usar un camino mucho más corto, como 0,1 cm.

El factor de dilución tiene en cuenta cualquier dilución realizada antes de la medición. Si una muestra concentrada diera una absorbancia superior a 1,0, es habitual diluirla antes con tampón. El factor de dilución es igual al volumen total diluido dividido entre el volumen de la muestra original. Por ejemplo, mezclar 10 μL de muestra con 990 μL de tampón da un volumen total de 1.000 μL, es decir, un factor de dilución de 100.

Otras formas de medir la concentración de proteínas

La absorbancia a 280 nm es uno de varios métodos habituales en un laboratorio.

• Ensayo de Bradford: usa un colorante que cambia de color al unirse a la proteína. Funciona bien con muestras sin purificar, pero el cambio de color puede variar entre proteínas distintas.
• Ensayo de BCA: se basa en un cambio de color provocado por los enlaces peptídicos de la proteína. Es compatible con muchos detergentes, pero tarda más en realizarse que una lectura directa de absorbancia.
• Método de Lowry: un método más antiguo, muy sensible, pero que reacciona mal con algunos componentes habituales de los tampones.

Cada uno de estos tres métodos destruye la muestra. Una medición directa de A280 no lo hace, por lo que la misma muestra puede recuperarse y volver a usarse.

Preguntas frecuentes

¿Cuál es el intervalo de absorbancia ideal para este método?

Entre 0,1 y 1,0. Por debajo de 0,1, la lectura es imprecisa. Por encima de 1,0, la relación entre la absorbancia y la concentración puede dejar de ser una línea recta, por lo que conviene diluir antes la muestra.

¿Por qué medir a 280 nm en lugar de a 260 nm?

Los ácidos nucleicos, como el ADN y el ARN, absorben con fuerza a 260 nm. Las proteínas absorben más a 280 nm por su contenido de triptófano y tirosina. Medir a 280 nm reduce la interferencia de los ácidos nucleicos que haya en la muestra.

¿Cómo se halla el coeficiente de extinción de una proteína que no figura en la lista?

Para una proteína de secuencia conocida, una herramienta como ProtParam lo calcula a partir del número de residuos de triptófano, tirosina y cistina. También puede medirse directamente, comparando la absorbancia de la muestra con la de una solución de concentración conocida.

¿Funciona este método con una mezcla de proteínas?

Funciona mejor con una sola proteína purificada y de coeficiente de extinción conocido. Una mezcla de proteínas desconocidas, como un lisado celular, suele medirse en cambio con el ensayo de Bradford o el de BCA, ya que esos métodos dan una estimación más uniforme de la proteína total.

¿Pueden los detergentes interferir en la lectura?

Sí. Muchos detergentes absorben luz cerca de 280 nm, lo que puede distorsionar el resultado. Usar una muestra en blanco que contenga la misma concentración de detergente ayuda a cancelar esa absorbancia de fondo. Con concentraciones muy altas de detergente puede ser necesario recurrir a un ensayo compatible con detergentes, como el de BCA.

Referencias

1. SIB Swiss Institute of Bioinformatics, ExPASy. ProtParam documentation. Documentación de ProtParam — coeficiente de extinción a 280 nm en agua a partir de Ext(Tyr) = 1490, Ext(Trp) = 5500 y Ext(Cystine) = 125; método de Gill y von Hippel (1989), coeficientes de Pace et al. (1995).