Calculadora de Temperatura de Hibridación de ADN | Herramienta Gratuita de Tm de PCR
Calcule la temperatura de hibridación óptima de PCR a partir de la secuencia de cebadores. Cálculo instantáneo de Tm utilizando la regla de Wallace. Herramienta gratuita con análisis de contenido de GC para un diseño preciso de cebadores.
Calculadora de Temperatura de Hibridación de ADN
Acerca de la Temperatura de Hibridación de ADN
Documentación
¿Qué es una calculadora de la temperatura de alineamiento del ADN?
Una calculadora de la temperatura de alineamiento del ADN estima la temperatura de fusión (Tm) de un cebador de ADN a partir de su secuencia. La Tm es la temperatura a la que la mitad de las moléculas del cebador están unidas a su cadena diana y la otra mitad no. En una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), este valor orienta la temperatura utilizada para que los cebadores se unan al molde de ADN.
Por qué es importante la temperatura de alineamiento en la PCR
La PCR copia un fragmento diana de ADN mediante ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento. Cada ciclo tiene tres pasos. Primero, el calor separa el molde de doble cadena a aproximadamente 95 °C. Este paso se denomina desnaturalización. Segundo, la reacción se enfría hasta la temperatura de alineamiento, normalmente entre 50 °C y 65 °C, para que los cebadores cortos puedan unirse a secuencias coincidentes de las cadenas simples. Tercero, la temperatura aumenta hasta aproximadamente 72 °C, y una enzima llamada ADN polimerasa alarga los cebadores para formar nuevas cadenas de ADN.
Si la temperatura de alineamiento es demasiado baja, los cebadores se unen a secuencias que solo coinciden parcialmente, lo que produce fragmentos de ADN adicionales no deseados. Si es demasiado alta, los cebadores no pueden formar un enlace estable con el molde y se copia poco ADN o no se copia ninguno. La temperatura de alineamiento es uno de los primeros parámetros que los investigadores ajustan cuando una reacción de PCR falla.
Cómo afecta el contenido de GC a la Tm
Un cebador se empareja con su diana mediante enlaces de hidrógeno. Un par guanina-citosina (G-C) forma tres enlaces de hidrógeno. Un par adenina-timina (A-T) forma dos. Un cebador con más bases G y C necesita más calor para separarse, por lo que tiene una Tm más alta que un cebador de la misma longitud con más bases A y T. El contenido de GC suele expresarse como un porcentaje: el número de bases G y C dividido por la longitud total de la secuencia, multiplicado por 100.
Fórmula de la temperatura de alineamiento del ADN
Esta calculadora aplica una de dos fórmulas, elegida según la longitud del cebador.
Para cebadores de 14 nucleótidos o más, utiliza la fórmula del contenido de GC de Marmur-Doty:
N_GC es el número de bases G y C del cebador, contado directamente y no como porcentaje. N es el número total de bases.
Para cebadores de menos de 14 nucleótidos, utiliza la regla de Wallace:
A, T, G y C representan cada una el número de bases de ese tipo en el cebador.
Ambas fórmulas suponen condiciones habituales de PCR: aproximadamente 50 nanomolar de cebador y 50 milimolar de Na+.
Ejemplo resuelto
Considérese el cebador de 19 bases ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Su longitud es 19, que es 14 o más, por lo que la calculadora utiliza la fórmula de Marmur-Doty.
- Longitud (N) = 19
- recuento de G = 5, recuento de C = 5, por lo que N_GC = 10, y el contenido de GC es 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
- Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C
La fórmula utiliza el número de bases GC, 10, no el porcentaje de GC, 52,6. Usar por error el porcentaje da una Tm cercana a 143 °C, un valor que no es realista para una reacción de PCR realizada entre 50 °C y 95 °C.
Cómo utilizar esta calculadora
Escriba o pegue una secuencia de cebador utilizando únicamente las letras A, T, G y C. La calculadora muestra la longitud de la secuencia en nucleótidos (nt), el contenido de GC como porcentaje y la temperatura de alineamiento calculada en grados Celsius. El resultado puede copiarse para las notas de laboratorio o para un protocolo.
Elección de la temperatura de alineamiento de la PCR
La Tm es una estimación calculada, no una temperatura de trabajo garantizada. Muchos protocolos comienzan la etapa de alineamiento real unos grados por debajo de la Tm calculada y después ajustan la temperatura según el resultado observado en un gel. Para un par de cebadores, normalmente se utiliza como punto de partida el menor de los dos valores de Tm. La PCR en gradiente, que ejecuta simultáneamente varias reacciones en un intervalo de temperaturas, es una forma habitual de encontrar la temperatura óptima mediante pruebas.
Otras formas de estimar la Tm
Las fórmulas de Marmur-Doty y de Wallace utilizadas aquí son aproximaciones rápidas basadas únicamente en la composición de bases. Existen otros métodos:
- La termodinámica del vecino más próximo tiene en cuenta cómo afecta cada par de bases adyacentes a la estabilidad y se considera el método más preciso para los cebadores estándar.
- Las fórmulas con corrección por sal añaden un ajuste para la concentración de iones Na+ o K+ en el tampón de reacción, ya que una mayor concentración salina estabiliza el dúplex de ADN y eleva la Tm.
Distintas calculadoras pueden proporcionar valores de Tm diferentes para el mismo cebador porque utilizan fórmulas distintas. La prueba final sigue siendo realizar la PCR y comprobar el resultado.
Preguntas frecuentes
¿Qué es la temperatura de alineamiento del ADN?
Es la temperatura a la que los cebadores de ADN se unen a su secuencia coincidente en una cadena molde durante la PCR. En los laboratorios normalmente se ajusta unos grados por debajo de la temperatura de fusión (Tm) calculada del cebador.
¿Cómo se calcula la Tm de un cebador?
Para cebadores de 14 bases o más, Tm = 64,9 + 41 × (número de bases GC − 16,4) / longitud. Para cebadores de menos de 14 bases, Tm = 2 × (número de bases A+T) + 4 × (número de bases G+C).
¿Por qué el contenido de GC eleva la Tm?
Los pares de bases G-C forman tres enlaces de hidrógeno, frente a los dos de los pares A-T. Un cebador con una proporción mayor de bases G y C necesita más energía y, por tanto, una temperatura más alta para separarse de su diana.
¿Debe ser la temperatura de alineamiento de la PCR igual a la Tm calculada?
No. La mayoría de los protocolos comienzan varios grados por debajo de la Tm calculada y ajustan la temperatura a partir de ahí, porque la Tm marca el punto en el que solo la mitad del cebador está unida.
¿La longitud del cebador cambia la Tm?
Sí, aunque no de una manera sencilla. La longitud aparece en el denominador de la fórmula de Marmur-Doty, por lo que un cebador más largo con un contenido de GC medio no tiene automáticamente una Tm más alta que uno más corto y rico en GC.
¿Por qué no coinciden las distintas calculadoras de Tm?
Utilizan fórmulas diferentes. La regla de Wallace, la fórmula del contenido de GC de Marmur-Doty, la termodinámica del vecino más próximo y las fórmulas con corrección por sal pueden proporcionar valores de Tm distintos para el mismo cebador, a veces con diferencias de varios grados.
Referencias
- Marmur J, Doty P. Determinación de la composición de bases del ácido desoxirribonucleico a partir de su temperatura de desnaturalización térmica. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
- Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hibridación de oligodesoxirribonucleótidos sintéticos con ADN phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
- SantaLucia J Jr. Una visión unificada de la termodinámica de vecinos más próximos del ADN en polímero, mancuerna y oligonucleótido. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.